Einfluss einer persistierenden Infektion mit dem kaninen Staupevirus auf kanine histiozytäre Sarkomzellen im Maus-Xenotransplantationsmodell

Aufgrund der zahlreichen Todesfälle, die sowohl bei Menschen als auch bei Hunden durch Neoplasien hervorgerufen werden, ist die Erforschung und Behandlung von Tumoren ein bedeutsames Feld der Wissenschaft. Oft liegt eine Resistenz der Tumoren gegenüber Radio- oder Chemotherapien vor, sodass hier neue Verfahren notwendig sind. In der Literaturübersicht der vorliegenden Arbeit wird ein vielversprechender neuer Therapieansatz, die virale Onkolyse, vorgestellt. Hierbei wird vor allem auf die ersten Anfänge verglichen mit aktuellen Studien eingegangen und verschiedene Wirkmechanismen und Modifikationen von onkolytischen Viren werden vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine Diskussion des Tumormikromilieus und Möglichkeiten seiner Beeinflussung. Im Rahmen einer Beschreibung von Morbilliviren, die in mehreren Studien bereits ihr onkolytisches Potenzial bewiesen haben, wird auch das kanine Staupevirus (CDV) vorgestellt. Des Weiteren erfolgt eine Erklärung des kaninen histiozytären Sarkoms, eines aggressiven Tumors, der aus Makrophagen, Monozyten und/oder dendritischen Zellen hervorgeht. Die Literaturübersicht schließt mit einer Übersicht über murine Xenotransplantationsmodelle und bisherige Studien mit Staupevirus-Infektionen von DH82-Zellen, einer Zelllinie, die aus dem Knochenmark eines an der disseminierten Form des histiozytären Sarkoms leidenden Hundes isoliert wurde.

In der vorliegenden Arbeit wurde diese Zelllinie für ein murines Xenotransplantationsmodell zur Erforschung des onkolytischen Potentials des CDV verwendet. Besonderes Augenmerk galt dabei der intratumoralen Applikation von DH82 Zellen, die persistierend mit dem CDV-Stamm Onderstepoort (CDV Ond) infiziert waren (DH82 CDV Ond p.i. Zellen). So wurden die Tumoren nach einer Wachstumsphase von 35 Tagen entweder ein- oder zehnmalig, wobei jeden zweiten Tag eine Injektion erfolgte, mit CDV Ond p.i. Zellen infiziert. Als Kontrollen dienten Tumoren, die zehnmal mit nicht-infizierten DH82 Zellen bzw. mit UV-inaktivierten, homogenisierten DH82 CDV Ond p.i. Zellen injiziert wurden. Es erfolgte jeden zweiten bis dritten Tag eine Volumenbestimmung der Tumoren.

Die Ergebnisse wurden mit denen einer vorausgegangenen Studie verglichen, bei der unter gleichen Bedingungen eine einmalige, intratumorale Injektion mit CDV Ond bzw. mit UV-inaktiviertem CDV Ond durchgeführt wurde. Diese vorausgegangene Studie beschränkte sich jedoch auf die Erhebung der klinischen Daten, sodass die oben aufgeführten Gruppen im Folgenden in die weiteren Untersuchungen inkludiert wurden. Nach der Sektion wurden die Tumoren histologisch sowie immunhistologisch untersucht. Dabei wurden die Größe von Nekrosearealen, die intratumorale Gefäßdichte, die Mitoserate, der Anteil CDV-Nukleoprotein-positiver Zellen, und der Anteil an intratumoralen Makropagen (Mac3/CD107b positiven Zellen) sowie an apoptotischen Zellen (aktiverte Caspase 3 positiven Zellen) festgestellt. Neben einem Vergleich der Gruppen untereinander an einem Untersuchungszeitpunkt (Tag 77 nach der Transplantation), erfolgte bei den Gruppen, die zehn intratumorale Applikationen erhielten, zusätzlich eine Untersuchung der Parameter an verschiedenen Zeitpunkten (zusätzlich Tag 63 nach der Transplantation). Ein zuvor festgelegter, dritter Untersuchungszeitpunkt dieser Gruppen (Tag 119 nach der Transplantation) schied aus der statistischen Analyse aus, da einige Tiere vorzeitig euthanasiert werden mussten und die Gruppengröße somit nicht ausreichend war.

Des Weiteren wurde der Virusgehalt unter besonderer Berücksichtigung der Infektiosität (RT-qPCR sowie Virustitration mit anschließender Immunfluoreszenz) im Tumorgewebe untersucht. Hierbei wurde zusätzlich eine weitere Gruppe inkludiert, die in analoger Weise zu den oben beschriebenen Gruppen zehnmalige, intratumorale Applikationen mit CDV Ond erhielt und deren klinischen sowie histologischen und immunhistologischen Ergebnisse bereits in einer anderen Studie veröffentlicht wurden. Die Ergebnisse der vorgenannten Untersuchungen wurden nicht statistisch analysiert, da bei der Probennahme der Anteil intakten Tumorgewebes nicht genau bestimmt werden konnte.

Bezüglich der Volumenentwicklung stellte sich heraus, dass die Tumoren, denen zehnmalig DH82 CDV Ond p.i. Zellen injiziert wurden, an einigen Zeitpunkten eine signifikant kleinere prozentuale Tumorgröße aufwiesen als sämtliche anderen Gruppen. Auch die Gruppe, die eine einzelne intratumorale DH82 CDV Ond p.i. Zellinjektion erhielt, wies an einzelnen Untersuchungszeitpunkten statistisch signifikant kleinere prozentuale Tumorgrößen auf als einige der anderen Gruppen. Auch die histologischen und immunhistologischen Untersuchungsergebnisse wiesen auf eine onkolytische Wirkung einer CDV Infektion hin, wobei vor allem bei den Tumoren mit einer zehnmaligen DH82 CDV Ond p.i. Zellapplikation ein großer intratumoraler Nekroseanteil sowie eine reduzierte Gefäßdichte und Mitoserate festgestellt wurden. Es wurde keine Zunahme Caspase 3 positiver Zellen oder muriner Makrophagen bei den Tumoren mit zehnmaliger, intratumoraler Applikation von DH82 CDV Ond p.i. Zellen festgestellt. Mittels RT-qPCR wurde bei sämtlichen Tumoren, in die ein- oder zehnmal mit DH82 CDV Ond p.i. Zellen appliziert wurden, virale mRNA-Transkripte nachgewiesen. Die Untersuchung der akut infizierten Tiere verlief nur teilweise positiv. Infektiöses Virus konnte mittels Virustitration sowohl bei den Gruppen, die DH82 CDV Ond p.i. Zellen appliziert bekamen, als auch bei denjenigen, denen CDV Ond injiziert wurde, nur bei einem Teil der Tiere festgestellt werden. Dabei lag der späteste Untersuchungszeitpunkt, an dem ein zytopathischer Effekt beobachtet wurde, bei 62 Tagen nach der letzten Injektion mit DH82 CDV Ond p.i. Zellen.

Zusammenfassend konnte das onkolytische Potenzial des CDVs im vorliegenden Versuch bestätigt werden. Es wurde gezeigt, dass Injektionen mit persistierend infizierten Zellen wirkungsvoller zu sein scheinen als die direkte Applikation des Virus. Mit der Hemmung der intratumoralen Neovaskularisation wurde ein wichtiger Wirkmechanismus des CDVs aufgezeigt. Überraschenderweise war auch mehrere Wochen nach der letzten Applikation von DH82 CDV Ond p.i. Zellen infektiöses Virus in den Tumoren nachweisbar, auch wenn bei dem vorliegenden Versuch keine vollständige Tumorregression erreicht werden konnte. Jedoch könnten die hier erworbenen Erkenntnisse als Grundlage für zukünftige Studien dienen, in denen, beispielsweise durch den Einsatz von genetisch modifizierten Viren, in einem ähnlichen Therapieansatz vollständige Regressionen erzielt werden könnten.