Einfluss Hühnerovalbumin-spezifischer CD4- und CD8 positiver T-Zellen auf den Verlauf einer Infektion mit dem Theilerschen Murinen Enzephalomyelitisvirus bei Mäusen mit einem C57BL/6-Hintergrund

Wannemacher, Rouven

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Einfluss Hühnerovalbumin-spezifischer CD4- und CD8 positiver T-Zellen auf den Verlauf einer Infektion mit dem Theilerschen Murinen Enzephalomyelitisvirus bei Mäusen mit einem C57BL/6-Hintergrund

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Infektionen von Mäusen mit dem Theilerschen murinen Enzephalomyelitisvirus (TMEV) werden als Tiermodelle für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen bei Mensch und Tier genutzt. Eine intrazerebrale Infektion empfänglicher Mausstämme mit Viren der Theiler’s original (TO) TMEV-Subgruppe verursacht eine chronisch demyelinisierende Erkrankung in Gehirn und Rückenmark, (TMEV-induzierte demyelinisierende Erkrankung, TMEV-IDD), deren Verlauf dem der chronisch progressiven, humanen Multiplen Sklerose gleicht. Eine Infektion von TMEV-IDD-resistenten C57BL/6-Mäusen (BL6) mit dem Daniel’s Stamm (TMEV-DA) verursacht in einem Teil der infizierten Mäuse Läsionen und Krankheitserscheinungen ähnlich der humanen Epilepsie.

Bei OT-Mäusen handelt es sich um transgene Mäuse mit Hühnerovalbumin (OVA) spezifischen T-Zellen auf einem BL6-Hintergrund. Es existieren OT-I-Mäuse mit einer fast ausschließlich OVA-spezifischen CD8⁺ T-Zell-Population und mit einer damit einhergehenden relativen Reduktion von CD4⁺ T-Zellen. Zudem existieren OT-II-Mäuse mit einer fast ausschließlich OVA-spezifische CD4⁺ T-Zell-Population. Damit einher geht eine relative Reduktion von CD8⁺ T-Zellen. Bei beiden OT-Stämmen ist die Gesamtzahl an T-Zellen unverändert im Vergleich zu BL6- Mäusen.

Ein vollständiger CD4- bzw. CD8 Knockout induziert bei Mäusen mit BL6-Hintergrund einen Verlust der Resistenz gegen TMEV.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, den Einfluss nicht Virusantigen-spezifisch reaktionsfähiger T-Zell-Populationen auf den Krankheitsverlauf nach TMEV-Infektion bei Mäusen mit BL6-Hintergrund zu untersuchen. Hierzu wurden OT-I-, OT-II- und BL6-Wildtyp-Mäuse (WT) intrazerebral mit TMEV-BeAn-1 infiziert. Die Tiere wurden wöchentlich klinisch und neurologisch untersucht. Histologische Analysen wurden an Hämatoxylin-Eosin- und Luxol fast Blue gefärbten Schnitten durchgeführt. Für immunhistochemische Untersuchungen wurden Markierungen von TMEV-, CD3 (T-Zellen) -, CD4 (T-Helferzellen) -, CD8 (zytotoxische T-Zellen) -, Iba1 (Mikroglia/Makrophagen) -, Caspase3 (Apoptosen) - und βAPP (geschädigte Axone) Antigen durchgeführt.

Alle OT-I-Mäuse entwickelten eine schwere klinische Symptomatik und wurden innerhalb von 35 Tagen nach Infektion (dpi) aus Tierschutzgründen euthanasiert. Nur 60% aller OT-II-Mäuse (12 von 20) zeigten klinische Symptome. 25% dieser Mäuse (3 von 12) erholten sich vollständig und zeigten bis zum Ende des Versuchs (42 bzw. 147 dpi) keine weiteren klinischen Auffälligkeiten. Fünf OT-II-Mäuse zeigten einen ähnlichen Krankheitsverlauf wie OT-I-Mäuse und wurden innerhalb von 37 dpi aus Tierschutzgründen euthanasiert. Die verbleibenden 4 erkrankten OT-II-Mäuse wurden planmäßig 14 dpi euthanasiert. WT-Mäuse entwickelten keine klinische Erkrankung. Die zerebrale Infiltration durch T-Zellen zeigte sich bei OT-I- und OT-II-Mäusen verzögert im Vergleich zu WT-Mäusen, wobei OT-I-Mäuse eine langsamere Einwanderung aufwiesen als OT-II-Mäuse. Dieser Unterschied wurde hauptsächlich von CD8⁺ T-Zellen ausgemacht. Bei der Infiltration von CD4⁺ T-Zellen zeigten nur bei euthanasierten Tieren OT-II-Mäuse eine verstärkte Reaktion im Vergleich zu OT-I-Mäusen. Hingegen zeigten OT-I-Mäuse und OT-II-Mäuse mit schweren Erkrankungssymptomen so gut wie keine zerebrale Infiltration von CD8⁺ T-Zellen. Insgesamt war jedoch die CD8⁺ T-Zell-Reaktion sowohl bei OT-I-, als auch bei OT-II-Mäusen verzögert im Vergleich zu WT. OT-I-Mäuse wiesen als einzige Versuchsgruppe große Mengen intrazerebralen Virusantigens und eine Virusausbreitung ins Rückenmark. Verglichen mit OT-II- und WT-Mäusen zeigten OT-I-Mäuse außerdem eine initial (7dpi) verzögerte Mikroglia-Reaktion. Nach 14 dpi wiesen beide OT-Maus-Stämme eine verstärkte Mikrogliose im Vergleich zu WT-Mäusen auf. Zudem zeigten OT-I-Mäuse einen erhöhten Grad neuronaler Apoptosen im Gehirn, verglichen mit beiden anderen Versuchsgruppen. Keine Versuchsgruppe zeigte Demyelinisierung und alle Versuchsgruppen zeigten einen ähnlichen Grad axonaler Schädigung.

Zusammenfassend verdeutlichen die durchgeführten Untersuchungen eine erhöhte Empfänglichkeit von OT-Mäusen für TMEV-Infektion. Die zugrundeliegenden Prozesse scheinen bei den beiden Stämmen jedoch zu divergieren. Während OT-I-Mäuse eine hauptsächlich virusassoziierte Krankheitsentwicklung zeigen, zeigen OT-II-Mäuse eine durch Mikrogliose und CD4⁺ T-Zell-Infiltration geprägte Pathogenese.

An infection of mice with Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) is used as an animal model for several neurodegenerative diseases. An intracerebral infection of susceptible mice with the Theiler’s original (TO) subgroup causes a chronic demyelinating disease (TMEV-induced demyelinating disease, TMEV-IDD), similar to human chronic progressive multiple sclerosis. An infection of TMEV-IDD-resistant C57BL/6-mice (BL6) with the Daniel’s strain of TMEV (TMEV-DA) causes lesions and clinical disease mirroring human epilepsy.

OT-mice are transgenic mice on a BL6-background, carrying chicken-ovalbumin (OVA) specific T-cell populations. OT-I-mice have nearly exclusively OVA-specific CD8⁺ T-cells and a relative reduction of the unaltered CD4⁺ T-cells. OT-II-mice on the other hand display almost exclusively CD4⁺ T-cells with a relative reduction of CD8⁺ T-cells. Both mouse strains show an unaltered total T-cell count compared to BL6-wildtype mice (WT).

Complete CD4- and CD8-knockouts have previously been shown to cause a loss of resistance to TMEV-infection.

The aim of this study was to elucidate the influence of T-cell populations without virus-antigen specific reactivity in mice on a BL6-background on disease progression and pathomorphologic alterations after infection with TMEV. OT-I-, OT-II- and BL6-WT-mice were intracerebrally infected with TMEV-BeAn-1. All animals underwent weekly clinical and neurological examination. Histological analysis was performed using hematoxylin-eosin (HE) and Luxol fast blue (LFB) stained sections of brain and spinal cord. Immunohistochemical analysis was performed using sections of brain and spinal cord marked for the presence of TMEV-, CD3 (T-cells)-, CD4 (T-helper cells)-, CD8 (cytotoxic T-cells)-, Iba1 (microglia/macrophages)-, Caspase3 (apoptosis)- and βAPP (axonal damage)-antigen, respectively.

All OT-I-mice developed severe clinical disease and were euthanized for humane reasons within 35 days post infection (dpi). Only 60% of OT-II-mice (12 of 20) developed clinical disease. Out of these, 25% (3 of 12) made a full clinical recovery and displayed no further signs of disease until the end of the experiment (42 and 147 dpi, respectively). Five OT-II-mice displayed similar disease progression to OT-I-mice and were euthanized for humane reasons within 37 dpi. The remaining 4 OT-II-mice with clinical symptoms were euthanized at their planned necropsy date at 14dpi. BL6-WT-mice did not develop clinical disease. OT-I- and OT-II-mice both displayed delayed cerebral T-cell-infiltration compared to BL6-WT-mice, with OT-I-mice displaying an increased delay of infiltration compared to OT-II-mice. This difference mainly consisted of CD8⁺ T-cells. Both OT-I- and OT-II-mice displayed a delayed cerebral infiltration of CD8⁺ T-cells compared to BL6-WT, with only OT-II-mice eventually reaching similar levels to BL6-WT. OT-I- and OT-II-mice euthanized for humane reasons both displayed an almost complete lack of CD8⁺ T-cells in the brain. CD4⁺ T-cell infiltration was similar across almost all groups and time points with only euthanized OT-II-mice displaying a significant increase over euthanized OT-I mice. Only OT-I-mice displayed large quantities of cerebral TMEV-antigen and were also the only study group to display virus spread into the spinal cord. OT-I-mice displayed a delayed onset microglia reaction compared to OT-II- and BL6-WT-mice. By 14 dpi, however, both OT-strains displayed increased microgliosis compared to BL6-WT-mice. Additionally, OT-I-mice showed an increased number of neuronal apoptosis, compared to both other study groups. No study group displayed demyelination in LFB-staining and axonal damage was similar across all study groups and time points.

In conclusion, these results show an increased susceptibility of OT-I- and OT-II-mice to TMEV-infection. However, the underlying mechanisms appear to be different for both strains. OT-I-mice display an almost complete absence of CD8⁺ T-cells and severe virus load, indicating a mainly virus-associated pathogenesis. OT-II-mice, on the other hand, display no increased virus load, but immunopathology in the form of microgliosis and CD4⁺ T-cell infiltration seems to be the main cause of disease.