Entwicklung und Validierung von Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)-Assays als schnelle und sensitive Nachweismethoden für Listeria monocytogenes, Bacillus cereus und Staphylococcus aureus in Lebensmitteln

Der Verbraucherschutz und die amtliche Lebensmittelüberwachung sehen sich immer wieder mit lebensmittelassoziierten Zoonoseerkrankungen und Lebensmittelvergiftungen konfrontiert. Gerade Listeria monocytogenes stellt ein hohes Infektionsrisiko für bestimmte Bevölkerungsgruppen dar und birgt das Risiko, eine tödliche Listeriose auszulösen. Aber auch bakterielle Toxine können schwerwiegende Krankheitsverläufe bis hin zum Tod bedingen. Die eng verwandten Mitglieder der Bacillus cereus-Gruppe beherbergen potenziell toxinbildende Bakterienstämme. Bei der Aufnahme von Toxinen oder Bakterienzellen mit der Nahrung können diese Erbrechen oder Durchfall und Bauchkrämpfe bis hin zum Multi-Organversagen verursachen. So auch Bakterien, die zur Familie der Staphylococcaceae gehören, wie Staphylococcus aureus. Sie verursachen lokal begrenzte Infektionen der Haut und Weichteile, so wie auch schwerwiegende, systemische Krankheitsverläufe wie beispielweise Lungenentzündungen, Endokarditiden bis hin zur Sepsis. Bei Tieren sind sie außerdem verantwortlich für Mastitiden und können bei Milchkühen die Milchproduktion beeinträchtigen, die Milch kontaminieren und sind somit auch als Zoonose relevant für die Lebensmittelsicherheit. Toxinbildende Staphylokokken-Stämme können beim Menschen neben äußeren Infektionen auch lebensmittelbedingte Intoxikationen auslösen. Im Vordergrund steht hier die Fähigkeit der koagulasepositiven Staphylokokken, mit S. aureus als ihrem wichtigsten Vertreter, Staphylokokken-Enterotoxine (SEs) und Enterotoxin-ähnliche (SE-like) Proteine zu bilden. Daher ist es zur Prävention solcher Ausbruchsgeschehen besonders wichtig, Lebensmittel zuverlässig und schnell auf diese Erreger hin zu untersuchen. Ein Verfahren, welches sich hier für neuartige Ansätze anbietet, beruht auf der Amplifikation von Nukleinsäuren in Form der Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Diese Methode erfordert einen geringen Geräteaufwand, ist kostengünstiger als herkömmliche Methoden und ist weniger arbeits- und somit auch zeitintensiv. Für alle drei Erreger existieren LAMP-Assays mit verschiedenen Zielregionen, diese zeigten jedoch an vielen Stellen Schwächen und beruhten auf weniger belastbaren Daten oder es fehlen Untersuchungen, um die Anwendbarkeit im Lebensmittel sicher zu ermöglichen.

So war es Ziel dieser Studie, L. monocytogenes in Lebensmitteln mit der LAMP-Methode schnell, spezifisch und empfindlich, unter Berücksichtigung aller relevanter Serotypen nachzuweisen. Die Reaktionen für diesen, wie auch für die anderen beiden Assays wurde mit dem tragbaren Echtzeit-Fluorometer Genie^® II (OptiGene Ltd., Horsham, UK) durchgeführt und etabliert. In diesem neuen LAMP-Assay heften sich sechs Primer an die mpl-Gensequenz von L. monocytogenes an. Eine 100%-ige Spezifität wurde anhand von 148 verschiedener Isolate, darunter 105 L. monocytogenes und 43 Nicht-L. monocytogenes-Stämme, bestätigt. Die analytische Sensitivität lag bei 5 pg DNA oder 275 KbE pro Reaktion. Auch künstlich kontaminiertes Rinderhackfleisch und geriebener Mozzarella wurden getestet. Der Assay war zu 100% erfolgreich beim Nachweis einer anfänglichen bakteriellen Kontamination von 0,4-4 KbE/g Lebensmittel nach 24-stündiger Anreicherung. Dies ermöglicht es, Kontaminationen im Rahmen des Lebensmittelsicherheitskriteriums von 100 KbE/g Probe sicher nachzuweisen. Auch bei der Untersuchung von Nativproben konnten 100% übereinstimmende Ergebnisse zwischen LAMP und der Standardkulturmethode nach der ersten Anreicherung für 24 Stunden erzielt werden. Darüber hinaus wurde eine schnelle Koloniebestätigungsmethode etabliert, die eine zuverlässige Identifizierung von L. monocytogenes-Isolaten auf verschiedenen Selektivkulturmedien unter Verwendung einer vereinfachten DNA-Extraktion durch einen thermischen Zellaufschluss sicherstellt. Diese im Rahmen dieser Dissertation vorgelegte Studie zeigt, dass der entwickelte Test in der Lage ist, festzustellen, ob ein Lebensmittel im Hinblick auf die Lebensmittelsicherheitskriterien von 100 KbE/g den Normen der Europäischen Union für L. monocytogenes sicher ist, und schnellere Ergebnisse als die kulturelle Referenzmethode liefert.

Herausfordernd war die Zielgenselektion für eine sinnvolle Untersuchung von Lebensmitteln mit dem Fokus auf B. cereus. Die eng verwandten Mitglieder der B. cereus-Gruppe können meist nur durch WGS unterschieden werden und nicht alle Vertreter dieser Gruppe sind toxinbildend. Bislang gibt es zwar keinen EU-weiten Schwellenwert, aber eine Keimzahl von 10⁵ KbE/g kann als kritisch angesehen werden. Ein spezifischer und schneller Nachweis der Bakterien ist aufgrund ihrer engen Verwandtschaft schwierig und bisher wurde kein LAMP-Assay als Nachweis potenziell toxinbildender Mitglieder der B. cereus-Gruppe entwickelt. Untersuchungen in diesem Bereich berufen sich auf meist komplexe Toxin-Nachweise oder weniger aussagekräftige Genomanalysen, welche keinen adäquaten Rückschluss auf das krankheitsauslösende Potenzial zuließen. Daher wurde eine LAMP-Methode entwickelt, welche zum einen spezifisch und schnell kritische Zellzahlen von potenziell nicht-hämolytischen Enterotoxin (NHE)-produzierenden Zellen dieser Gruppe nachweisen kann. Es wurde daher ein zweistufiger LAMP-Assay entwickelt, welcher zunächst Vertreter der B. cereus-Gruppe über die Zielsequenz groEL nachweist und in der zweiten Ebene durch den Nachweis des nheB-Gens einen Rückschluss auf die Möglichkeit zur Produktion von Enterotoxinen zulässt. Trotz der hohen genetischen Homogenität der Gruppe betrug die Spezifität des entwickelten Assays 100% für Isolate der B. cereus-Gruppe und 93,7% für den Nachweis von nheB. Die analytische Sensitivität betrug je 0,1 pg DNA/µl. Für groEL und nheB waren 11,35-27,05 KbE pro Reaktion bzw. 11,35-270,5 KbE pro Reaktion nachweisbar. Unter Verwendung einer vereinfachten DNA-Extraktionsmethode konnte bei diesem Assay der Geräte- und Materialaufwand noch weiter reduziert werden. Diese Methode fand auch Anwendung im Nachweis der Erreger in Lebensmitteln, zunächst an künstlich kontaminierten Proben. Der direkte Nachweis des kritischen Wertes von Zellen der B. cereus-Gruppe war in 83,3% der Proben möglich, der Nachweis des Toxin-Gens in 50% der Proben. Nach einer sechsstündigen Inkubationszeit stieg die Nachweisrate auf 100% bzw. 91,7%. Somit können schnell verlässliche Ergebnisse erzielt werden. Im letzten Schritt wurden auch hier 100 nativ kontaminierte Lebensmittelproben getestet und zusätzlich quantitativ und kulturell auf das Vorhandensein der Erreger überprüft. Proben mit relevanten Kontaminationsgraden wurden mit groEL-LAMP zuverlässig nachgewiesen. Nach einer sechsstündigen Inkubationszeit konnten auch Isolate, die das Toxin-Gen nheB tragen, sicher nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde Koloniematerial gekocht und als LAMP-Template für den einfachen Nachweis verwendet. Die Spezifität für die B. cereus-Gruppe betrug 100% und 93,22% für den Nachweis von nheB. Somit zeigt diese Studie, dass das Screening von Lebensmittelproben mit dem groEL/nheB-LAMP-Assay innerhalb eines Tages mit geringem technischen Aufwand durchgeführt werden kann, wodurch es möglich ist, kritische Mengen an potenziell NHE-Toxin produzierenden Zellen der B. cereus-Gruppe nachzuweisen. Damit lassen sich Krankheitsausbrüche weitestgehend verhindern, weil große Probenmengen einer routinemäßigen Überprüfung unterzogen werden können.

Als letzter Erreger rückte ebenfalls ein Toxinbildner in den Fokus dieser Arbeit. Die Spezies S. aureus beherbergt enterotoxigene Stämme, welche sich im Lebensmittel auf Werte von >10⁵ KBE/g vermehren müssen, bevor relevante Mengen an Toxin nachweisbar sind. Laut der Beobachtungen der EFSA stellt dieser Erreger eine häufig auftretende Spezies dar, welche stets ein Risiko für Erkrankungen birgt. Da auch bei diesem Keim ein genetischer Nachweis des tatsächlich produzierten Toxins nicht zuverlässig möglich ist, und bis zum Zeitpunkt der Etablierung dieses Assays kein Gen beschrieben wurde, welches eine hohe Korrelation zwischen Exprimierung und Toxinproduktion aufweist, wurde der Fokus auf die koagulasepositiven Staphylokokken gelegt, welche auch Zielkeime der klassischen kulturellen Nachweismethoden sind. Im Rahmen des Lebensmittelsicherheitskriteriums wird nur von dem Nachweis der Staphylokokken-Enterotoxine in Käse, Milch- und Molkepulver, gemäß den Kriterien für koagulasepositive Staphylokokken, gesprochen. Hier gilt eine Nulltoleranz während der Haltbarkeitsdauer von in den Verkehr gebrachten Lebensmitteln. Im Rahmen des Prozesshygienekriteriums gilt für Milch und Milcherzeugnisse ein Grenzwert von 10⁵ KbE/g, da angenommen wird, dass ab diesem Keimgehalt relevante Mengen von Enterotoxine produziert werden. Der kulturelle Nachweis ist sehr zeit- und arbeitsaufwendig. Viele bisher entwickelte LAMP-Assays beschäftigen sich vor allem mit den für diese Studie weniger relevanten MRSA oder arbeiteten mit einem hohen Geräteaufwand und weisen einige Lücken gerade im Hinblick auf die Anwendung am Lebensmittel auf. Daher wurde an dieser Stelle angesetzt, einen geeigneten Assay zu entwickeln. Die Zielgensequenz hsp60 wurde als geeignet ermittelt und eine 100%-ige Spezifität anhand von 99 S. aureus, 17 Staphylococcus spp. (excl. S. aureus) und 52 non-S. aureus-Isolaten erreicht. Zudem zeichnet sich der Assay durch eine niedrige analytische Sensitivität aus. 0,1 pg/µl DNA konnten zuverlässig nachgewiesen werden. Unter Verwendung von Lysostaphin, einer Staphylococcus ssp. Metalloendopeptidase, konnte die DNA-Ausbeute aus Zellen so weit optimiert werden, dass es gelang, 18,625 KbE pro Reaktionsansatz eines Referenzstammes bzw. 24,1 KbE pro Reaktionsansatz eines Feldstammes nachzuweisen. Definierte Zellgehalte in künstlich konatminierten Lebensmitteln wurden ebenfalls getestet. Nach sechs Stunden Anreicherung war es möglich, unabhängig vom verwendeten Isolat, Ausgangskontaminationen von 1-100 KbE/g bzw. nach 24 Stunden 0,01-10 KbE/g verlässlich zu detektieren. Dies ermöglicht einen Nachweis im Rahmen des Lebensmittelsicherheitskriterium und legt die Option offen, eine belastbare Aussage darüber zu treffen, ob so viele Keime im Lebensmittel vorhanden sind, dass es sich um ein potenziell krankmachendes Produkt handeln könnte. Im letzten Entwicklungsschritt wurde der Assay anhand von 91 Nativproben geprüft. Nach 24 Stunden Inkubation war es möglich, sicher das Vorhandensein von S. aureus nachzuweisen und mit der kulturellen Methode übereinstimmende Resultate zu liefern. Dies war auch nach 6 Stunden nahezu möglich; lediglich vier Proben wiesen hier in der kulturellen Nachweismethode verdächtige Kolonien auf, waren aber mittels LAMP noch negativ.

Alle entwickelten LAMP-Assays bieten somit die Möglichkeit zur kostengünstigen und schnellen Probenanalyse. Gerade gegenüber der klassischen mikrobiologischen Untersuchung zeigte sich ein großer Vorteil. Zudem ist unter eingeschränkten Laborbedingungen, wie z.B. in mobilen Einheiten, dennoch eine Untersuchung umsetzbar und so Lebensmittelinfektionen zuverlässig unwahrscheinlicher zu machen und das Risiko dieser signifikant zu senken.