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The effect of a CD28-receptor knockout on the Theiler’s murine encephalomyelitis virus-model

The Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) is an enteric picornavirus of the genus cardiovirus with a prominent neurotropism. Experimental intracerebral inoculation of mice with low virulent strains of TMEV results in an acute encephalitis with infection of neurons that can progress into a chronic infection, with virus persistence in glial cells and progressive demyelination of the central nervous system (CNS) white matter, depending on the genotype of the infected mouse strain. C57BL/6 mice are considered as TMEV-resistant, since they are able to eliminate the virus from their CNS during the acute encephalitis that lasts about 14 days post infection (dpi). Although the acute encephalitis is in general subclinical, it can be accompanied by acute as well as chronic seizures in resistant mouse strains.  Susceptible mouse strains, like SJL mice, are affected by virus persistence and develop a partly autoimmune TMEV-induced demyelinating disease (TMEV-IDD) that is associated with progressive ataxia and loss of motor function. According to the neurotropism of the virus and the distinct clinical signs accompanying the pathomorphology, the intracerebral TMEV-infection is used as an animal model for human neuroinflammatory and –degenerative diseases, like epilepsy and multiple sclerosis (MS).

The trigger of MS is still unclear and viral etiologies, in particular Epstein-Barr-virus- as well as herpes-virus-infections, have only recently become the focus of research. So far, many treatment options against this neuroinflammatory and autoimmune disease have been developed with great success. However, the unclear etiology hampers the development of a preventive, protective or curative treatment. A major part in MS treatment is to influence the immune response of the patient to prevent further immune-mediate damage to the CNS.

One key molecule in the activation of an immune response is the CD28-receptor on T cells. It is constitutively expressed during the development of the T cell within the thymus and is needed as a co-stimulatory receptor for the T cell receptor (TCR). Only the interaction of a presented antigen with the TCR in combination with co-stimulation of CD28 will result in a proper activation of the T cell.

In the presented study, different mouse strains on a resistant C57BL/6 background with conventional as well as conditional knockout of CD28 were infected intracerebrally with low virulent TMEV-BeAn. Aim of the study was to elucidate the role of the CD28 receptor during neuroinflammation and most importantly during a virus infection of the CNS. It is known that a CD28-knockout can prevent the development of autoimmunity in animal models. However, with respect to possible viral triggers for MS, the presented study aimed to expand the knowledge about CD28 as a possible target molecule for treatment options under infectious conditions. Furthermore, the effects of a conditional CD28-knockout, respective of a sudden treatment onset, were compared to a conventional knockout, respective of an immune system that is already adapted to the loss of CD28-signaling.

The presented results show that, in contrast to C57BL/6 wild-type mice, both CD28-knockout strains are unable to clear TMEV from their CNS within 14 dpi and are affected by a virus spread within the brain and into the spinal cord. This, for C57BL/6 mice atypical, virus spread was in both CD28-knockout strains associated with reduced microglial activation. While the conditional knockout mice also showed increased T cell- and almost no B cell infiltration into the CNS, the B- and T cell response of conventional knockout mice mostly resembled those of infected wild-type controls without knockout.

Surprisingly, the conditional CD28-knockout was further associated with a high clinical score and weight loss, that led to the premature termination of the experiment at 14 dpi for this mouse strain.

Consequently, only the conventional CD28-knockout mice were included in the long-term study. During the maximum observation period of 42 or 147 dpi, respectively, 33% of the conventional knockout mice developed mild ataxia (earliest at 21 dpi) and progressive loss of motor function up to hind limb paresis at 33 or 35 dpi. Conventional CD28-knockout mice that developed ataxia did not show amelioration of motor function until 42 dpi. The clinical signs were associated with persistent TMEV-infection and ongoing neuroinflammation, characterized by increased micro- and astrogliosis as well as increased T- and B-cell infiltration within the brain and spinal cord. Furthermore, increased axonal damage within the spinal cord was detectable in these chronically infected mice.

It was concluded, that the outcome of a CD28-knockout largely depends on the time point of induction. In general, the conditional knockout with a sudden loss of CD28-signaling had detrimental effects on the affected animal. The results further indicated that the high clinical score and weight loss of these animals were not exclusively linked to the TMEV-infection. It is suspected that also other immunopathological factors, which have yet to be further elucidated, might have contributed to their clinical disease.

The different outcome between a conventional and conditional as well as the heterogeneity among the conventional CD28-knockout mice indicates that, in addition to a stereotypic response, individual compensatory mechanisms after chronic loss of CD28-signaling seem to play a crucial role for disease prevention or progression. The mechanism behind this might be rooted in individual expression or upregulation of other co-stimulatory molecules in the absence of CD28.

Furthermore, the presented study provides a very important insight into the outcome of an infectious process in a host with a dysregulated immune response.

Das murine Theiler-Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) ist ein enterisches Picornavirus der Gattung Cardiovirus welches, wie viele andere Picornaviren, einen ausgeprägtem Neurotropismus aufweist. Die experimentelle intrazerebrale Inokulation von Mäusen mit niedrig virulenten TMEV-Stämmen führt zu einer akuten Enzephalitis mit primärer Infektion von Neuronen, die sich, je nach Genotyp der infizierten Maus, zu einer chronischen Infektion mit Viruspersistenz in den Gliazellen und fortschreitender Demyelinisierung der weißen Substanz des zentralen Nervensystems (ZNS) entwickeln kann. C57BL/6-Mäuse gelten als TMEV-resistent, da sie in der Lage sind, das Virus während der akuten Enzephalitis, die etwa 14 Tage nach der Infektion (dpi) andauert, aus dem ZNS zu eliminieren. Obwohl die akute Enzephalitis im Allgemeinen subklinisch verläuft, kann sie bei resistenten Mausstämmen sowohl von akuten als auch von chronischen epileptiformen Anfällen begleitet sein. Anfällige Mausstämme wie SJL-Mäuse zeigen eine lebenslange Viruspersistenz und entwickeln eine teilweise autoimmune TMEV-induzierte demyelinisierende Erkrankung (TMEV-IDD), die mit fortschreitender Ataxie und Verlust der motorischen Fähigkeiten einhergeht. Entsprechend dem Neurotropismus des Virus und den ausgeprägten klinischen Symptomen, die die Pathomorphologie begleiten, wird die intrazerebrale TMEV-Infektion als Tiermodell für menschliche neuroinflammatorische und -degenerative Erkrankungen wie Epilepsie und Multiple Sklerose (MS) verwendet.

Der Auslöser der MS ist weiterhin unklar, obwohl virale Ätiologien, insbesondere chronische Epstein-Barr-Virus- sowie Herpesvirus-Infektionen seit kurzem in den Fokus der Forschung gerückt sind. Bisher wurden viele Behandlungsmöglichkeiten gegen die Autoimmunerkrankung MS mit großem Erfolg entwickelt. Die unklare Ätiologie behindert jedoch die Entwicklung einer präventiven, protektiven oder final heilenden Therapie. Ein wesentlicher Teil der MS-Behandlungen besteht darin, die Immunantwort des Patienten zu beeinflussen, um eine weitere immunvermittelte Schädigung des ZNS zu verhindern.

Ein Schlüsselmolekül für die Induktion einer Immunantwort ist der CD28-Rezeptor auf T-Zellen. Er wird konstitutiv bereits während der Entwicklung der T-Zellen im Thymus exprimiert und wirkt als co-stimulatorischer Rezeptor für den T-Zell-Rezeptor (TCR). Nur die Interaktion eines präsentierten Antigens mit dem TCR in Kombination mit einer CD28-vermittelten Co-Stimulation führt zu einer vollständigen Aktivierung der T-Zelle.

In der vorgestellten Studie wurden verschiedene Mausstämme auf einem genetisch resistenten C57BL/6-Hintergrund mit angeborenem (konventionellem) sowie induzierbarem (konditionellem) Knockout von CD28 verwendet. Die verschiedenen CD28-Knockout-Stämme sowie die Kontrolltiere ohne Knockout wurden im Rahmen der Untersuchung intrazerebral mit niedrig virulentem TMEV-BeAn infiziert.

Ziel der Studie war es, die Rolle des CD28-Rezeptors während einer Enzephalomyelitis unter besonderer Berücksichtigung einer Virusinfektion des ZNS aufzuklären. Es ist bekannt, dass der CD28-Knockout die Entwicklung von Autoimmunität in Tiermodellen für menschliche Erkrankungen verhindern kann. Im Hinblick auf mögliche virale Auslöser der MS erweitert die vorgestellte Studie die bisherigen Erkenntnisse zu dem CD28-Rezeptor als mögliches Zielmolekül für Behandlungsoptionen unter infektiösen Bedingungen. Weiterhin wurden die Auswirkungen eines konditionellen CD28-Knockouts, entsprechend eines akuten Abbruchs der CD28-Co-Stimulation, mit einem konventionellen Knockout, als Beispiel eines bereits an den Verlust des CD28-Signalwegs angepassten Immunsystems, verglichen.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass im Gegensatz zu C57BL/6-Wildtypmäusen beide CD28-Knockout-Stämme nicht in der Lage sind, TMEV innerhalb von 14 Tagen nach der Infektion aus ihrem ZNS zu eliminieren. Darüber hinaus konnte bei beiden Knockout-Stämmen eine für C57BL/6-Mäuse ungewöhnliche Ausbreitung des Virus innerhalb des Gehirns, sowie ins Rückenmark festgestellt werden. Diese Virusausbreitung war in beiden CD28-Knockout-Stämmen mit einer reduzierten Mikroglia-Aktivierung verbunden. Während die konditionellen Knockout-Mäuse eine erhöhte T-Zell- und fast keine B-Zell-Infiltration in das ZNS zeigten, ähnelte die B- und T-Zell-Antwort konventioneller Knockout-Mäuse größtenteils denen der infizierten Wildtyp-Kontrollen ohne Knockout.

Überraschenderweise war der konditionelle CD28-Knockout außerdem mit einem hohen klinischen Score und Gewichtsverlust verbunden, was zum vorzeitigen Abbruch des Experiments nach 14 Tagen post infectionem, beziehungsweise 9 Tage nach der Induktion des CD28-Knockouts, bei diesem Mausstamm führte.

Folglich wurden nur die konventionellen CD28-Knockout-Mäuse in die Langzeitstudie aufgenommen. Während des maximalen Beobachtungszeitraums von 42 bzw. 147 dpi entwickelten 33 % der konventionellen Knockout-Mäuse eine leichte Ataxie (frühestens nach 21 Tagen) und einen fortschreitenden Verlust der Motorik bis hin zur Parese der Hintergliedmaßen in zwei Fällen an Tag 33 bzw. 35 nach der Infektion. Konventionelle CD28-Knockout-Mäuse die eine Ataxie entwickelten zeigten während des Beobachtungszeitraums keine Verbesserung der motorischen Funktionen. Die klinischen Symptome waren mit einer persistierenden TMEV-Infektion und einer anhaltenden Enzephalomyelitis verbunden, die durch eine verstärkte Mikro- und Astrogliose sowie Infiltration von T- und B-Zellen in Gehirn und Rückenmark gekennzeichnet war. Darüber hinaus wurde ebenfalls ein verstärkter Axonschaden im Rückenmark der betroffenen Tiere festgestellt.

Es wurde geschlussfolgert, dass das Ergebnis eines CD28-Knockouts während einer Virusinfektion des ZNS stark vom Zeitpunkt der Induktion abhängt. Im Allgemeinen hatte der konditionelle Knockout mit einem plötzlichen Verlust der CD28-Co-Stimulation nachteilige Auswirkungen auf das betroffene Tier. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass der hohe klinische Score und der Gewichtsverlust dieser Tiere möglicherweise nicht ausschließlich mit der TMEV-Infektion in Zusammenhang standen.

Es wird vermutet, dass auch andere immunpathologische Faktoren, die noch näher aufgeklärt werden müssen, zu der auffälligen klinischen Erkrankung der konditionellen Knockoutmäuse beigetragen haben könnten.

Das unterschiedliche Ergebnis zwischen einem konventionellen und konditionalen CD28-Knockout als auch die Heterogenität unter den konventionellen CD28-Knockout-Mäusen deutet darauf hin, dass nach chronischem Verlust der CD28-Co-Stimulation zusätzlich zu der stereotypischen Reaktion ebenfalls individuelle Kompensationsmechanismen eine entscheidende Rolle für die Prävention oder Progression der Erkrankung spielen. Der Mechanismus dahinter könnte in einer individuellen Expression oder Hochregulierung anderer co-stimulatorischer Moleküle in Abwesenheit von CD28 verwurzelt sein.

Die vorgestellte Studie liefert zudem einen wichtigen Einblick in die Folgen einer Dysregulation des Immunsystems unter infektiösen Bedingungen.

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