Role of intestinal integrity and cecal microbiota in Enterococcus cecorum infection in broilers

Enterococcus cecorum (EC) ist einer der relevantesten bakteriellen Erreger in der heutigen Masthühner-Produktion. EC verursacht erhebliche ökonomische Verluste aufgrund erhöhter Mortalitätsraten, der tierschutzgerechten Tötung von lahmen und gelähmten Tieren, hoher Therapiekosten und erhöhter Verwurfraten am Schlachthof. Zurzeit ist die Pathogenese der Erkrankung nur teilweise bekannt. Die Besiedlung des Darms durch pathogene EC-Stämme scheint der erste entscheidende Schritt zu sein, auf den dann die bakterielle Translokation aus dem Darm, eine Septikämiephase sowie Lahmheit aufgrund von entzündlichen Veränderungen des freien Brustwirbels und Femurkopfnekrosen folgen. Bestehende Behandlungsoptionen beschränken sich im Wesentlichen auf die antibiotische Therapie der Infektion. Diese sollte so früh wie möglich eingesetzt werden, da die chronischen Knochenläsionen nicht therapierbar und somit irreversibel sind. Die genauen Effekte der antibiotischen Behandlung im Rahmen von EC-Infektionen sind bisher nicht untersucht worden. Des Weiteren wurde über mögliche Prädispositionsfaktoren, wie beispielsweise Hitzestress, zwar in Ansätzen bereits diskutiert, aber es wurden noch keine experimentellen Studien zu diesem Thema durchgeführt. Sowohl eine antibiotische Behandlung als auch Hitzestress können potentiell nachteilige Einflussfaktoren auf die Mikrobiota im Darm und die Darmintegrität darstellen. Bisher ist über die Rolle der Darmintegrität und der Darm-Mikrobiota bei EC-Infektionen noch nichts bekannt. Daher war das Ziel dieses PhD-Projektes herauszufinden, ob die genannten Faktoren zur Entstehung der Erkrankung beitragen können und weiter zu definieren, wann, wie und warum EC aus dem Darm in extra-intestinale Gewebe auswandert.

Das Ziel des ersten Experimentes (Manuskript I) war die Etablierung eines Infektionsmodells für EC in kommerziellen Broiler-Eintagsküken. Es war bereits vor dem Versuch vermutet worden, dass verschiedene EC-Stämme eine unterschiedliche Virulenz aufweisen können, obwohl die sichere Unterscheidung in kommensale und pathogene Stämme bisher nicht möglich ist. Aus diesem Grund wurden im ersten Experiment zwei verschiedene EC-Stämme (EC14 und EC15) in zwei verschiedenen Infektionsdosen eingesetzt, um am Ende die Feldsituation mit dem Modell bestmöglich abbilden zu können. Beide Stämme waren ursprünglich aus Feldausbrüchen isoliert worden und hatten eine hohe Embryoletalität (> 80 %) in entsprechenden Assays hervorgerufen. Die Tiere wurden täglich klinisch beobachtet und es wurden wöchentlich Sektionen durchgeführt. Intestinale und extra-intestinale Gewebe wurden mittels Kultur und real-time PCR auf EC untersucht. In dem hier durchgeführten Experiment induzierte nur der Stamm EC14 den typischen Krankheitsverlauf mit den charakteristischen Symptomen und pathologischen Veränderungen der Septikämie und der skelettalen Erkrankungsphase. In den mit EC14 infizierten Gruppen konnte EC bei etwa 23 % der Tiere aus extraintestinalen Geweben kulturell isoliert werden. Diese Isolationsrate war unabhängig von der genutzten Infektionsdosis. Im Gegensatz dazu hat der Stamm EC15 keinerlei klinische Symptome oder pathologische Veränderungen verursacht und EC konnte in den entsprechenden Gruppen auch nicht aus extraintestinalen Geweben isoliert werden. Das Manuskript I enthält damit den ersten experimentellen Nachweis, dass nicht alle EC-Stämme die Erkrankung hervorrufen können und dass somit verschiedene EC-Stämme unterschiedliche Virulenzlevel aufweisen.

Das zweite Experiment (Manuskript II) sollte zur Untersuchung der Effekte einer antibiotischen Behandlung der EC-Infektion mit Lincomycin-Spectinomycin auf den Krankheitsverlauf und die zäkale Mikrobiota dienen. Das im ersten Experiment etablierte Infektionsmodell wurde daher zur Untersuchung der Effekte einer frühzeitigen antibiotischen Behandlung von EC-Infektionen innerhalb der ersten Lebenswoche genutzt. Als Untersuchungsmethoden wurden die kulturelle Untersuchung, real-time PCR und die Illumina-Sequenzierung angewendet. Während bei ungefähr 25 % der unbehandelten, EC-infizierten Tiere in verschiedenen extraintestinalen Geweben über den gesamten Versuchsverlauf EC nachgewiesen werden konnte, verhinderte die Behandlung mit Lincospectin nach erfolgter EC-Infektion vollständig die Entstehung der Erkrankung. Es konnten keinerlei pathologische Veränderungen festgestellt werden und EC konnte aus den untersuchten extraintestinalen Geweben auch kulturell nicht isoliert werden. Daraus lässt sich schließen, dass die antibiotische Behandlung der EC-Infektion erfolgreich war. Allerdings konnten mittels Illumina-Sequenzierung auch möglicherweise eher nachteilige Effekte der Behandlung auf die Zusammensetzung der Darm-Mikrobiota festgestellt werden. Direkt nach Abschluss der Behandlung an Studientag 7 wurden sehr hohe relative Häufigkeiten (> 50 %) der Gattung Escherichia/Shigella (Stamm Proteobacteria) im Zäkum der behandelten Tiere festgestellt, während die unbehandelten Tiere zu über 90 % durch Bakterien des Stammes Firmicutes besiedelt waren. Escherichia coli, ein Mitglied der Gattung Escherichia/Shigella, ist als weiterer wichtiger bakterieller Infektionserreger bei Masthühnern bekannt und weist eine intrinsische Resistenz gegen Lincomycin sowie hohe erworbene Resistenzraten gegen Spectinomycin auf. Daher ist es möglich, dass die Behandlung von EC-Infektionen die Entstehung weiterer bakterieller Infektionen begünstigen kann. Darüber hinaus wurden in diesem Experiment reduzierte Anteile an Lactobacillus spp. sowie eine verminderte Speziesdiversität festgestellt, die die Darmgesundheit nachteilig beeinflussen könnten. Im Gegensatz zur antibiotischen Behandlung hatte die EC-Infektion keinen wesentlichen Einfluss auf die Zusammensetzung der Darm-Mikrobiota und basierend auf dem verhältnismäßig sehr geringen Anteil der Gattung Enterococcus an der gesamten zäkalen Mikrobiota (< 1 %) scheint EC eine eher untergeordnete Rolle innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft zu spielen.

Das dritte Experiment (Manuskript III) hatte die Untersuchung des Einflusses von Hitzestress auf die Darmintegrität und die zäkale Mikrobiota im Rahmen einer EC-Infektion zum Ziel. Nach EC-Infektion am ersten Lebenstag wurden die Masthühner daher in diesem Versuch innerhalb der ersten Lebenswochen unter thermoneutralen oder unter Hitzestress-Bedingungen gehalten. Extra-intestinale Proben wurden mittels Kultur auf EC untersucht und intestinale Proben wurden mittels real-time PCR, Ussing Kammer-Experimenten und Illumina-Sequenzierung analysiert. Basierend auf dem früheren Beginn klinischer Symptome, einem beobachteten Trend hinsichtlich erhöhter extra-intestinaler EC-Isolationsraten und erhöhter zäkaler EC-Kolonisationsraten kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass der Verlauf der Erkrankung in betroffenen Herden durch Hitzestress beschleunigt und verstärkt werden kann. Die Effekte von Hitzestress und EC-Infektion auf die zäkale Mikrobiota sind hingegen eher gering ausgefallen. Die Ergebnisse der Illumina-Sequenzierung unterstreichen allerdings die aus dem zweiten Experiment gezogene Hypothese, dass EC eine eher untergeordnete Rolle innerhalb der Mikrobiota einnimmt. Nichtsdestotrotz scheint EC eine Schlüsselspezies in den Tieren zu sein, die unter bestimmten Umständen empfänglich für die EC-assoziierte Erkrankung sind. Sowohl der Hitzestress als auch die EC-Infektion führten zur Herunterregulierung der mRNA-Expression von sogenannten tight junction-Proteinen, die auf eine mögliche Störung der Darmintegrität in dieser frühen Phase der Erkrankung hindeuten. Im Allgemeinen scheint die erste Woche nach EC-Infektion eine entscheidende Phase für die bakterielle Translokation innerhalb der Pathogenese der EC-assoziierten Lahmheit zu sein.

Insgesamt bietet diese Arbeit neue Einblicke in die Pathogenese der EC-assoziierten Erkrankung. Es wurde ein verlässliches und reproduzierbares Infektionsmodell für EC in Masthühner-Eintagsküken etabliert, das eine sehr gute Basis für alle weiteren Untersuchungen bietet. Es konnten verschiedene Virulenzlevel einzelner EC-Stämme nachgewiesen werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, EC-Stämme in Zukunft sicher nach ihrer Pathogenität einstufen zu können und ihre Virulenz festzustellen. Obwohl EC innerhalb der zäkalen Mikrobiota eine sehr geringe Häufigkeit aufweist, scheint diese Spezies eine Schlüsselrolle in erkrankten Tieren einzunehmen. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die Besiedlung des Darmes und die bakterielle Translokation innerhalb der ersten Lebenswoche grundlegend für die Pathogenese der EC-assoziierten Erkrankung sind. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch nicht bekannt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse, die in diesem Projekt gewonnen wurden und in dieser These diskutiert werden, auf die Notwendigkeit weiterer Forschung hinsichtlich der bakteriellen Translokationsmechanismen und möglicher Virulenzfaktoren von EC hinweisen.