role of cytotoxins in interactions of Streptococcus pneumoniae and Streptococcus suis with primary microglial cellsThe

Jennert, Franziska

Dissertation 2022 CC BY-NC-SA 4.0

Published

The role of cytotoxins in interactions of Streptococcus pneumoniae and Streptococcus suis with primary microglial cells

German
English

Streptococcus (S.) pneumoniae und S. suis können beide Meningitis und Meningoenzephalitis in Menschen und Tieren auslösen. S. pneumoniae ist der häufigste Erreger von bakterieller Meningitis und Meningoenzephalitis beim Menschen, mit einer Mortalitätsrate von bis zu 37 % in Ländern mit hohem Pro-Kopf-Einkommen. S. suis ist hauptsächlich ein Infektionserreger in Schweinen, allerdings können auch Menschen erkranken. S. suis und S. pneumoniae besitzen gemeinsame wichtige virulenzassoziierte Faktoren: die Kapsel und die Zytotoxine Pneumolysin (Ply) in S. pneumoniae und Suilysin (Sly) in S. suis. S. pneumoniae bildet außerdem Wasserstoffperoxid (H₂O₂) als weiteres Toxin. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss die Toxine beider Bakterien auf primäre murine Mikroglia zu untersuchen. Mikroglia unterscheiden sich von anderen Makrophagen und sind die im Gehirn beheimateten Phagozyten. Die Effekte auf primäre Mikroglia wurden mit denen in aus murinem Knochenmark differenzierten Makrophagen (BMDM) verglichen. Diese Arbeit untergegliedert sich in drei Teile. Der erste Teil befasst sich mit dem Einfluss von S. pneumoniae mittels Ply und H₂O₂auf primäre Mikroglia und BMDM und der zweite Teil mit dem Einfluss von S. suis sowie des Toxins Sly auf primäre Mikroglia, Astrozyten und BMDM. Im dritten Teil wird der Einfluss von Hypoxie auf die Zytotoxizität von Ply und Sly auf primäre Mikroglia, BMDM sowie die Zelllinie J774 untersucht.

Während der in vitro Infektion mit S. pneumoniae wurden primäre Mikroglia, nicht aber BMDM, abgetötet. Der Zelltod war nicht abhängig von Ply, sondern von H₂O₂, welches von S. pneumoniae produziert wurde. Obwohl Ply und H₂O₂ beide für Wirtszellen toxisch sein können, waren, in Bezug auf die von S. pneumoniae während der Infektion produzierten Mengen, nur die sehr niedrige H₂O₂ Konzentrationen nötig, um Mikroglia abzutöten. Ply und H₂O₂ wurden von S. pneumoniae, in Relation zur Bakterienanzahl, in vergleichbaren Mengen in CSF und Medium gebildet. BMDM waren effizienter im Abtöten von S. pneumoniae, sodass keine Akkumulation großer Toxinmengen stattfand.

Primäre Mikroglia, Astrozyten und BMDM überlebten die in vitro Infektion mit S. suis. Eine niedrige Zytotoxizität von S. suis wurde während der Infektion von Primärzellen beobachtet. Des Weiteren waren Makrophagen nicht empfindlich gegenüber niedrigen Konzentrationen von Sly. Jedoch wurden in primären Mikroglia und BMDM durch S. suis die Produktion von proinflammatorische Zytokinen induziert. Ein Protokoll für die Doppelimmunfluoreszenz-färbung von S. suis wurde etabliert um extra- und intrazelluläre Bakterien in primären Mikroglia zu detektieren, allerdings wurden intrazelluläre S. suis selten beobachtet.

Die rekombinanten (r) Toxine rPly und rSly wurden in Bezug auf ihre zytotoxische Wirkung auf primären Mikroglia, BMDM und der Zelllinie J774 unter normoxischen (21 % O₂) und hypoxischen (1 % O₂) Bedingungen getestet. Unter Normoxie wurde eine höhere Zytotoxizität im Vergleich zur Hypoxie festgestellt, dabei war die zytotoxische Wirkung von rPly größer als die von rSly. Die Toxine verursachten nur leichte zytotoxische Effekte in primären Makrophagen. Von den getesteten Makrophagen war die Zelllinie J774 am empfindlichsten gegenüber den Toxinen und primäre Mikroglia am unempfindlichsten.

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass primäre Mikroglia nicht von S. suis, jedoch schnell von S. pneumoniae mittels des produzierten H₂O₂ abgetötet wurden. Die rekombinanten Toxine verursachten, im Vergleich zu Studien an Zelllinien, sehr milde zytotoxische Effekte auf primäre Mikroglia, welche sich unter Hypoxie weiter verringerten.

Streptococcus (S.) pneumoniae and S. suis can both cause meningitis and meningoencephalitis in humans and animals. S. pneumoniae is the most common cause of bacterial meningitis and meningoencephalitis in humans with a mortality rate of up to 37 % in high-income countries. S. suis infects pigs, but is also a human pathogen. S. pneumoniae and S. suis possess major virulence associated factors, which are common to both species: the capsule and the cytotoxins pneumolysin (Ply) in S. pneumoniae and suilysin (Sly) in S. suis. Moreover, S. pneumoniae produces another toxin, hydrogen peroxide (H₂O₂). The objective of this study was to investigate the impact of the bacterial toxins on primary murine microglia, the phagocytes residing in the brain, which are distinct from other macrophages. Effects were compared with those on murine bone marrow-derived macrophages (BMDM). This work comprises three topics, focusing on the effect of S. pneumoniae via Ply and H₂O₂ on primary microglia and BMDM in the first part, the influence of S. suis and Sly on primary microglia, astrocytes and BMDM in the second part, and the influence of hypoxia on the cytotoxicity of Ply and Sly on primary microglia, BMDM as well as the cell line J774 in the third part.

During in vitro infection with S. pneumoniae only primary microglia, but not BMDM, were killed during pneumococcal infection. The cell death was not dependent on Ply, but on H₂O₂, which is also produced by S. pneumoniae. Even though both can be toxic for host cells, in relation to the amounts produced by pneumococci during infection, very high amounts of Ply and low concentrations of H₂O₂ were necessary. Production of Ply and H₂O₂ by S. pneumoniae in relation to the bacterial number was comparable in cerebrospinal fluid and medium. BMDM were more effective than microglia in killing S. pneumoniae and, thereby, no accumulation of high amounts of pneumococcal toxins occurred.

Primary microglia, astrocytes and BMDM survived in vitro infection with S. suis. A low cytotoxicity of S. suis was determined throughout the infection of primary cells. Furthermore, the primary macrophages were not susceptible to Sly at low concentrations. Interestingly, there was a proinflammatory cytokine induction following in vitro S. suis infection in primary microglia and BMDM. A double immune fluorescence staining protocol was established to detect extra- and intracellular S. suis in microglia, but intracellular S. suis were rarely observed.

Recombinant (r) toxins rPly and rSly were tested in regard to their cytotoxicity on primary microglia, BMDM and the cell line J774 for comparison under normoxic (21 % O₂) and hypoxic (1 % O₂) conditions. A higher cytotoxicity was detected under normoxic conditions, whereby rPly was more cytotoxic than rSly. The toxins only caused mild cytotoxic effects on the primary macrophages; of the tested macrophages, the cell line J774 was most susceptible towards the toxins and primary microglia least.

In conclusion, the results of this study elucidate, that primary microglia were not harmed by S. suis, while microglia were rapidly killed by S. pneumoniae via the produced H₂O₂, but not Ply. The recombinant toxins only caused, very mild cytotoxic effects on primary microglia, in contrast to previous studies done with cell lines; the observed cytotoxicity was further diminished by hypoxia.