Phenotypic characterization of canine microglia/macrophages within the injured spinal cord following intervertebral disc degeneration

Kühl, Bianca

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Phenotypic characterization of canine microglia/macrophages within the injured spinal cord following intervertebral disc degeneration

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Traumatische Rückenmarksschädigungen kommen beim Hund häufig vor und ziehen ein breites Spektrum klinischer Symptome nach sich, welche von milden Rückenschmerzen bis hin zu Paraplegie und vollständigem Verlust der Nozizeption reichen. Wichtige Einblicke in die Pathophysiologie dieser Erkrankung wurden durch umfangreiche Forschungen an etablierten Nagetiermodellen gewonnen. Dennoch ist die Umsetzung der gewonnen Erkenntnisse in klinische Studien an Hunden oft unzureichend und 40-50% der Hunde mit Paraplegie und Verlust der Nozizeption erholen sich nicht und werden häufig euthanasiert. In den letzten Jahren hat die Anzahl an Studien zur Pathophysiologie von traumatischen Rückenmarksverletzungen bei Hunden im Interesse dieser geschätzten Gefährten zugenommen. Darüber hinaus stellen Hunde ein vielversprechendes Tiermodell für traumatische Rückenmarksschädigungen bei Menschen dar. Neuere Studien konzentrieren sich vor allem auf die entzündlichen Prozesse im Zuge der sekundären Schädigungen zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze.

Histiozytäre Zellen stellen eine interessante und heterogene Komponente der angeborenen Immunantwort mit vielen verschiedenen Vertretern in unterschiedlichen Geweben, wie zum Beispiel den Mikrogliazellen im zentralen Nervensystem, dar. Bei der Entzündung zeigen Mikroglia/Makrophagen vielfältige Funktionen, da sie zum einen als Hauptakteure der Entzündung Zytokine, Chemokine, Stickstoffradikale und Sauerstoffradikale sezernieren und zum anderen Zelltrümmer phagozytieren und die Wundheilung fördern. Aus diesem Grund werden Mikroglia/Makrophagen als zweischneidiges Schwert angesehen und die Beeinflussung ihres Phänotyps in eine wünschenswerte Richtung stellt ein vielversprechendes therapeutisches Ziel dar. Obwohl der Phänotyp von Mikroglia/Makrophagen in vitro in einen entweder pro- oder anti-inflammatorischen Status mit hoher Konformität der resultierenden Zellpopulation verändert werden kann, deuten verschiedene Studien auf komplexere Verhältnisse in vivo hin, was die Annahme aufkommen lässt, dass dieses simple bipolare Schema invivo nicht existiert. Dennoch stellt die Entschlüsselung des Phänotyps von Mikroglia/Makrophagen bei traumatischen Rückenmarksschädigungen einen grundlegenden Schritt zum tieferen Verständnis der Erkrankung selbst und potentieller künftiger Behandlungsstrategien dar.

Das Ziel dieser Studie war es den Phänotyp von Mikroglia/Makrophagen auf Proteinebene in vivo unter Berücksichtigung der Erkrankungsdauer zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde das Expressionsmuster von neun verschiedenen Antikörpern im Rückenmark von unverletzten Kontrollhunden (n=10), Hunden mit einer Erkrankungsdauer von bis zu vier Tagen (akut; n=9) und Hunden mit einer Erkrankungsdauer von fünf bis zehn Tagen (subakut; n=8) untersucht. Darüber hinaus wurde vergleichend der Phänotyp von Mikroglia/Makrophagen der grauen gegenüber der weißen Substanz des Rückenmarks untersucht. Schließlich wurde vergleichend der Phänotyp von Makrophagen in einem peripheren Immunorgan (Milz) von gesunden Hunden (n=5) als Referenz zu den Befunden des Rückenmarks untersucht.

Im Zuge traumatischer Rückenmarksschädigungen nehmen Mikroglia/Makrophagen zeitabhängig verschiedene Phänotypen an, was in der subakuten Phase der Erkrankung sichtbar wird. Bei akuten traumatischen Rückenmarksschädigungen finden keine bedeutenden Veränderungen im Phänotyp von Mikroglia/Makrophagen im Vergleich mit der Kontrollgruppe statt. Die erhöhte Expression von MAC387 ist auf die Infiltration neuer Monozyten/Makrophagen aus dem Blut zurückzuführen. Bei subakuten traumatischen Rückenmarksschädigungen nehmen Mikroglia/Makrophagen jedoch einen Abräum-Phänotyp mit Aufregulierung von CD18, CD204 und MHC-Ⅱ an, welche essentiell sind für Zelladhäsion, Migration und Phagozytose und für das Vorliegen einer resorptiven Entzündung sprechen. Die erhöhte Expression von CD204 von Mikroglia/Makrophagen im geschädigten Rückenmark ähnelt PAMS-assoziierten Makrophagen gesunder Hunde. Im Gegensatz zu PAMS-assoziierten Makrophagen zeigen Mikroglia/Makrophagen im geschädigten Rückenmark hohe Level an CD18. Dieses β-Integrin vermittelt Zelladhäsion und betont die Fähigkeit dieses Zelltyps in Richtung eines Gewebeschadens zu migrieren. Zudem ist es bemerkenswert, dass die Aufregulierung von CD18 und MHC-Ⅱ in der grauen und nicht in der weißen Substanz des geschädigten Rückenmarks stattfindet, welches möglicherweise auf die Phagozytose präsynaptischer Endigungen zurückzuführen ist. Die Ergebnisse dieser Studie deuten zudem auf eine untergeordnete Rolle von MPO und Lysozym bei der Pathogenese traumatischer Rückenmarksschädigungen hin. Dennoch sind weitere Studien nötig, um die Interaktionen von Mikroglia/Makrophagen mit anderen ortsständigen und infiltrierenden Immunzellen während akuter und subakuter traumatischer Rückenmarksschädigungen aufzuklären. Die Ergebnisse dieser Studie können zum künftigen Verständnis des Phänotyps und der Funktion von Mikroglia/Makrophagen bei traumatischen Rückenmarksschädigungen beitragen und die Übertragung in klinische Studien unterstützen. Daten aus vorherigen Studien zeigen eine großflächige Überlappung morphologischer, axonaler, glialer und immunologischer Reaktionen von Hunden mit anderen Spezies inklusive des Menschen. Dennoch ist noch vergleichsweise wenig über den zeitlichen Ablauf sekundärer Schäden bei Hunden nach traumatischen Bandscheibenvorfall-induzierten Rückenmarksschädigungen im Hinblick auf Immunantwort und Axonopathie bekannt. In dieser Hinsicht sind vor allem Informationen über chronische und fortgeschrittene Erkrankungsstadien noch nicht ausreichend vorhanden und interessanter Gegenstand zukünftiger Studien. Des Weiteren ist die Beschaffung der richtigen Proben bei solchen Fällen von einer gründlichen Kommunikation und Übermittlung anamnestischer Daten abhängig, da andernfalls solche Veränderungen bei der Obduktion übersehen werden könnten.

Traumatic spinal cord injury (SCI) is a common condition in dogs that causes a wide spectrum of clinical signs ranging from mild back pain to paraplegia and loss of nociception. Important insights in the pathophysiology of this condition have been gained from intensive research conducted in well-established rodent models. Yet, the translation of these findings into clinical trials in dogs is often insufficient and 40-50% of dogs with paraplegia and loss of nociception do not recover, eventually leading to euthanasia. In the past years, the number of studies focusing on the pathophysiological mechanisms of SCI in dogs have increased on the one hand in the interest of this beloved companion animal itself on the other because dogs comprise for several reasons a promising large animal model for SCI in humans. In search of promising new therapeutic approaches, recent studies focused on the underlying inflammatory processes during secondary injury.

Histiocytic cells are an interesting and heterogeneous part of the innate immune system with several representatives in different body tissues such as microglia in the central nervous system (CNS). During inflammation, microglia/macrophage functions are manifold as they are on the one hand main drivers of inflammation by secretion of cytokines, chemokines, nitrogen species and ROS but on the other hand phagocytose cellular debris and promote wound healing. Thus, microglia/macrophages are regarded as a double-edged sword and altering their phenotype in a beneficial direction is considered as a promising therapeutic target. Though microglia/macrophage phenotype can be polarized in vitro in either clear pro- or anti-inflammatory state with high conformity of the cell population, several studies indicate that the conditions in vivo are more complex, raising the assumption that a simple bipolar microglia/macrophage polarization system does not exist. However, elucidating the microglia/macrophage phenotype during SCI is pivotal for the deeper understanding of the disease and probable further treatment strategies.

The aim of the present study was to elucidate the microglia/macrophage phenotype on the protein level in vivo with consideration of disease duration. Therefore, we investigated the expression of nine different antibodies in the spinal cord of uninjured control dogs (n = 10), dogs with a disease duration of up to four days (acute; n = 9) and dogs with a disease duration of five to ten days (subacute; n = 8). Moreover, we comparatively investigated the microglia/macrophage phenotype within spinal cord gray and white matter. Finally, we comparatively evaluated the macrophage phenotype in a peripheral immune organ (spleen) of non-diseased dogs (n = 5) as a reference for the findings in the spinal cord.

During SCI, microglia/macrophages acquire time-dependent phenotypes in the gray and white matter of dogs that becomes evident in the subacute phase of the disease. During acute SCI, there are no major changes in microglia/macrophage phenotype between controls and acute SCI. The increased levels of MAC387 during acute SCI are related to recently infiltrating blood-borne monocytes/macrophages. However, during subacute SCI, microglia/macrophages acquire a scavenging phenotype with upregulation of CD18, CD204 and MHC-Ⅱ necessary for cell adhesion, migration and phagocytosis indicating a resorptive inflammation. Increased expression-levels of CD204 by microglia/macrophages in the injured spinal cord is similar to PAMS-associated macrophages under healthy conditions. In contrast to PAMS-associated macrophages, microglia/macrophages within the injured CNS display high levels of CD18. This β-integrin functions in cell adhesion and underlines the ability of this cell type to migrate to the areas of tissue damage. It is further remarkable, that upregulation of CD18 and MHC-Ⅱ occurs in the gray but not in the white matter of the injured spinal cord, which might be related to the early phagocytosis of pre-synaptic terminals. The findings of the present study also indicate that MPO and lysozyme play an ancillary role in the pathogenesis of SCI in dogs, yet further studies are necessary to elucidate the interactions of microglia/macrophages with other resident and infiltrating immune cells during acute and subacute SCI in detail. The findings of the present study might contribute to the further understanding of microglia/macrophage phenotype and function during SCI in dogs and support the translation into clinical trials. Data obtained from previous studies show a broad overlap of morphologic, axonal, glial and immune responses seen in dogs with other species including humans. However, comparatively little is known about the time course of secondary injury in dogs following intervertebral disc herniation-induced spinal cord injury, not only in the context of immune response but also axonopathy. In this context, data concerning chronic and advanced disease stages are lacking and represent and interesting target for future studies. Furthermore, the sourcing of appropriate material for pathological examination of such cases relies extensively on rigorous communication of anamnestic data to make sure previous alterations of the spinal cord are not overseen during necropsy.