Ultrastrukturelle Auswirkungen einer Sertoli-Zell-spezifischen Deletion des Connexin43-Gens auf die Regulation der Spermatogenese in transgenen Mäusen unter Verwendung des Cre/LoxP-Rekombinasesystems

Staggenborg, Sarah

Dissertation 2022 CC BY 4.0

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Ultrastrukturelle Auswirkungen einer Sertoli-Zell-spezifischen Deletion des Connexin43-Gens auf die Regulation der Spermatogenese in transgenen Mäusen unter Verwendung des Cre/LoxP-Rekombinasesystems

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Connexin43 ist das am häufigsten vorkommende Connexin im Hoden. Als Bestandteil von Gap Junction-Kanälen ist es für die interzelluläre Kommunikation von großer Bedeutung. Über Gap Junction-Kanäle sind innerhalb des Keimepithels sowohl Sertoli-Zellen miteinander verbunden als auch Sertoli-Zellen und Keimzellen. Aus vorangegangenen Studien ist bereits bekannt, dass eine veränderte Expression von Connexin43 im Zusammenhang mit Infertilität steht. Mithilfe eines translationalen Mausmodells wurde eine Mauslinie (SCCx43KO) generiert, welche durch einen Sertoli-Zell-spezifischen Knockout von Connexin43 charakterisiert ist. Homozygote, männliche Mäuse dieser Linie (SCCx43KO^-/-) sind infertil und zeigen einen Arrest der Spermatogenese sowie strukturelle Veränderungen der Keimtubuli.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Auswirkungen des Sertoli-Zell-spezifischen Knockouts von Connexin43 auf die Ultrastruktur der Sertoli-Zelle. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) -Aufnahmen zeigten morphologische Veränderungen in Connexin43-defizienten Sertoli-Zellen, wie etwa die Anhäufung von Lipiden sowie einen immaturen Kernphänotyp, daher wurden diese Aspekte als weitere Fragestellungen zusätzlich untersucht. Des Weiteren gab es Hinweise auf ein vermehrtes Vorkommen von Autophagie-assoziierten Strukturen in den Sertoli-Zellen von SCCx43KO^-/--Tieren, weshalb auch dieser Aspekt näher betrachtet werden sollte.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Ultrastruktur der Sertoli-Zelle insbesondere die des Zellkerns untersucht. Es zeigte sich, dass Sertoli-Zellkerne in SCCx43KO^-/--Mäusen oftmals weiter entfernt von der Basalmembran liegen und stattdessen intratubuläre Agglomerate/Cluster bilden. Die Beobachtungen weisen darauf hin, dass der Sertoli-Zell-spezifische Knockout von Connexin 43 offenbar zu einem Polaritätsverlust dieser Zellen führt. Darüber hinaus wiesen einige Kerne in adulten Knockout-Tieren Merkmale auf, welche auf Immaturität oder gar proliferierende Sertoli-Zellen hindeuteten. Diese Beobachtung betraf vor allem Sertoli-Zellen aus Clustern. Aus diesem Grund wurde mittels einer Doppelimmunfluoreszenz für Sox9 und BrdU der Aspekt der Proliferation tiefergehend untersucht. Es zeigten sich tatsächlich einige wenige BrdU-positive Sertoli-Zellen in intratubulären Clustern in adulten SCCx43KO^-/--Tieren, was ein Hinweis für die fortwährende Proliferation dieser Zellen war. Da Sertoli-Zellen von Knockout-Tieren auffallend viele Lipidtropfen aufwiesen, wurde dies mittels Sudan III-Färbung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) näher untersucht und anschließend quantifiziert. Es stellte sich heraus, dass Sertoli-Zellen in SCCx43KO^-/--Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Geschwistertieren durchschnittlich mehr Lipidtropfen enthielten. Auch wenn dieser Effekt in Clustern besonders betont war, konnte nachgewiesen werden, dass auch in basal lokalisierten Sertoli-Zellen mehr Lipidtropfen vorhanden waren.

Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit den Auswirkungen des Sertoli-Zell-spezifischen Knockouts von Connexin43 auf Autophagie innerhalb der Sertoli-Zelle. SBF-SEM-Aufnahmen gaben erste Hinweise auf ein vermehrtes Auftreten von Autophagie-assoziierten Strukturen in Sertoli-Zellen von SCCx43KO^-/--Mäusen. Dieser erste Eindruck konnte mittels TEM und LC3A/B-Immunhistochemie bestätigt werden. In Sertoli-Zellen als auch in Leydig-Zellen war ein stärkeres LC3A/B-Signal als in gleichartigen Zellen von Wildtyp-Tieren zu verzeichnen. Sertoli-Zell-Cluster wiesen mitunter die stärkste Immunreaktion auf. In ihnen war das LC3A/B-Signal nochmals stärker als in basal lokalisierten Sertoli-Zellen. Keimtubuli mit Restspermatogenese ähnelten in ihrer Signalstärke jedoch den Tubuli von Wildtyp-Geschwistertieren. In Folge der elektronenmikroskopischen Untersuchung mittels TEM fiel auf, dass in Sertoli-Zellen von SCCx43KO^-/--Mäusen auffällig viele Multilamellar Bodies auftraten, die oft in Gruppen angeordnet waren. Ihr Auftreten steht offenbar mit gesteigerter Autophagie im Zusammenhang.

Zusammenfassend wurden durch die vorliegende Arbeit auf ultrastruktureller Ebene weitere Erkenntnisse über die Rolle von Connexin43 innerhalb muriner Sertoli-Zellen sowie des Keimepithels gewonnen. Connexin43 scheint ein wichtiger Regulator der Sertoli-Zell-Struktur zu sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dessen Sertoli-Zell-spezifischer Knockout mit Veränderungen des Differenzierungszustandes von Sertoli-Zellen sowie metabolischen Veränderungen des Fettmetabolismus und Autophagie einhergeht.

Connexin43 is the most abundant connexin in the testis. As a component of gap junction channels, it is of vital importance for intercellular communication. In the seminiferous epithelium, gap junctions occur between Sertoli cells as well as between Sertoli cells and germ cells. As already known from previous studies, an altered connexin43-expression is associated with infertility. Using a translational mouse model, a mouse line (SCCx43KO) characterized by a Sertoli cell-specific knockout of connexin43 was generated. Homozygous male mice (SCCx43KO^-/-) are infertile, showing an arrest of spermatogenesis as well as structural alterations of seminiferous tubules.

The aim of this work was to investigate the effects of Sertoli cell-specific connexin43-loss on Sertoli cell ultrastructure. Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) images revealed morphological changes in connexin43-deficient Sertoli cells, such as an accumulation of lipid droplets as well as an immature nuclear phenotype. Therefore, these aspects were additionally investigated. In addition, there was evidence for an increased occurrence of autophagy-associated structures in Sertoli cells of SCCx43KO^-/- mice, thus this aspect should also be examined in more detail.

In the first part of the present work, the nuclear ultrastructure of the Sertoli cell was studied. In seminiferous tubules of SCCx43KO^-/- mice, Sertoli cell nuclei were often located more distant from the basement membrane, forming intratubular Sertoli cell-clusters. The alterations indicate that the Sertoli cell-specific knockout of connexin43 seems to result in a polarity loss. Moreover, some nuclei in adult knockout mice displayed features of immaturity or even proliferating Sertoli cells. This observation mainly concerned Sertoli cells from clusters. Therefore, using double immunofluorescence for Sox9 and BrdU, the aspect of proliferation was investigated more deeply. Indeed, a few BrdU-positive Sertoli cells appeared in intratubular clusters in adult mutants, indicating a continuous proliferation of these cells. Since Sertoli cells from knockout animals showed a conspicuous amount of lipid droplets, this was further investigated by Sudan III staining and transmission electron microscopy (TEM) and subsequently quantified. On average, Sertoli cells of SCCx43KO^-/- mice contained more lipid droplets compared to Sertoli cells of wild type littermates. Although this effect was particularly accentuated in clusters, it was demonstrated that more lipid droplets were also present in basally located Sertoli cells.

The second part of this study focused on the effects of the Sertoli cell-specific knockout of connexin43 on autophagy within the Sertoli cell. SBF-SEM images provided first evidence of an increased appearance of autophagy-associated structures in Sertoli cells of SCCx43KO^-/- mice. This first impression was confirmed by TEM and LC3A/B-immunohistochemistry. In Sertoli cells as well as in Leydig cells, the LC3A/B signal was stronger than in similar cells in wild type mice. Clustered Sertoli cells showed the strongest immunoreaction. In clusters, the LC3A/B signal was even stronger compared to basally located Connexin43-deficient Sertoli cells. However, seminiferous tubules showing residual spermatogenesis exhibited a comparable signal strength to seminiferous tubules of wild type littermates. Electron microscopic analysis by TEM revealed that Sertoli cells from SCCx43KO^-/- mice contained a striking number of multilamellar bodies, which were often arranged in groups. This phenomenon can apparently be associated with increased autophagy.

In summary, the present work has provided further insights at ultrastructural level into the role of connexin43 within murine Sertoli cells as well as the seminiferous epithelium. Connexin43 seems to be an important regulator of Sertoli cell nuclear structure. Furthermore, its Sertoli cell-specific knockout was shown to be associated with changes in the differentiation state of Sertoli cells as well as metabolic changes in lipid metabolism and autophagy.