Stability of cryopreserved stallion sperm during storage in dry ice
Im Rahmen der künstlichen Besamung von Stuten kommt der Nutzung von Tiefgefriersperma eine wachsende Bedeutung zu, sodass auch das Interesse an Versandmöglichkeiten des Tiefgefrierspermas steigt. Routinemäßig erfolgt der Versand in flüssigem Stickstoff, wobei aufgrund der Klassifizierung des Stickstoffs als Gefahrgut sowie durch verhältnismäßig teure Einweg-Kryocontainer erhebliche Transportkosten anfallen. In der aktuellen Studie wurde untersucht, ob kryokonserviertes Hengstsperma für den Versand in Trockeneis gelagert werden kann, ohne seine Lebens- und Befruchtungsfähigkeit zu verlieren. Darüber hinaus wurde untersucht, inwiefern die Lagerstabilität durch Zugabe der Polymere PVP-40 und Ficoll-70 erhöht werden kann. Diese Arbeit besteht aus vier Teilen: (I) Zunächst wurde festgestellt, dass dickwandige EPS-Styropor-Boxen, die mit 4,5 kg Trockeneis-Pellets gefüllt waren, für bis zu 100 h Temperaturen unter –70 °C hielten, und daher wurden sie für weitere Untersuchungen ausgewählt. (II) Anschließend wurde die Spermienviabilität (d. h. Motilität und Plasmamembranintegrität nach dem Auftauen) nach 72 h Lagerung in Trockeneis mit und ohne anschließende Rücklagerung der Proben in flüssigem Stickstoff bestimmt. Es wurde ein ähnlicher Prozentsatz an Membran-intakten und motilen Spermien ermittelt wie bei Proben, die in flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurden. Die Kryoüberlebensrate der Spermien war etwas höher, wenn dem Gefrierverdünner Polymere zugesetzt wurden. (III) Um Erkenntnisse über die kritische Temperatur für die Lagerung von kryokonserviertem Hengstsperma zu erhalten, wurden die Proben länger in Trockeneis gelagert, um eine Erwärmung auf unterschiedliche Temperaturen zu erreichen. Dabei zeigte sich, dass die kritischen Temperaturbereiche bei –50 bis –40 °C liegen, und dass die Zugabe von PVP und Ficoll bei in höheren Temperaturbereichen von Vorteil war. (IV) Schließlich wurde ein Besamungsversuch durchgeführt, um die Fruchtbarkeit von kryokonserviertem Hengstsperma nach Lagerung in Trockeneis zu bewerten. Der Versuch zeigte, dass sich die Trächtigkeitsraten nach Besamung mit kryokonserviertem, in Trockeneis gelagertem Sperma sich nicht von denen mit in flüssigem Stickstoff gelagertem Sperma unterschieden.
In equine breeding, the production and use of cryopreserved stallion sperm is becoming increasingly important. Routinely, frozen semen is shipped using liquid nitrogen, which has some drawbacks due to its classification as dangerous good and transport costs associated with using (disposable) cryo-containers. In the current study it was investigated if cryopreserved stallion sperm can be stored on dry ice for frozen transport without losing its viability and fertilizing capacity. Furthermore, it was investigated if addition of ice recrystallization inhibitors (i.e., the polymers PVP-40 and Ficoll-70) can be used to improve the stability of frozen samples. This work consists of four parts: (I) First, thick-walled EPS-Styrofoam boxes, filled with 4.5 kg dry ice pellets, were found to keep temperatures below –70 °C up to 100 h, and were chosen for further studies. (II) Then, sperm cryosurvival (i.e., motility and plasma membrane integrity post-thaw), was determined after 72 h storage in dry ice with or without relocation to liquid nitrogen. Similar percentages of membrane-intact and motile sperm post-thaw were determined as found for specimens that were maintained in liquid nitrogen. Sperm cryosurvival was slightly higher with polymers added to the cryopreservation medium. (III) To obtain insights in the critical temperature for storing of cryopreserved stallion sperm, specimens were subjected to longer storage in dry ice to provoke warming to different temperatures. Here it was found, that sperm cryosurvival was preserved as long as temperatures were kept below –50 °C. Furthermore, addition of PVP and Ficoll appeared beneficial for recovering higher cryosurvival upon reaching elevated subzero temperature. (IV) Finally, an insemination trial was performed to assess the fertility of cryopreserved stallion sperm after storage in dry ice. Using cryopreserved sperm stored in dry ice, numbers of pregnant mares were similar as with use of liquid nitrogen stored specimens.
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