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Pharmakologische Prävention von Schalltrauma-induziertem Hörverlust

Schalltrauma-induzierter Hörverlust stellt eine der Hauptursachen für Schallempfindungsschwerhörigkeiten dar. Die auslösende Lärmexposition findet entweder im Berufsumfeld oder in der Freizeit statt. Dabei ist sowohl eine einmalige starke als auch mehrmalige weniger traumatische Expositionen möglich. Durch die Unvorhersehbarkeit des Traumas sowie die Umstände des (Arbeits-) Umfeldes ist eine Prävention mittels konventionellen Gehörschutzes nicht in jeder Situation möglich. Deshalb rückt die pharmakologische Prävention in den Fokus der Wissenschaft. Der dem Krankheitsbild zugrunde liegende Pathomechanismus ist komplex. Dabei werden häufig die Ribbon-Synapsen, welche die Verbindung zwischen den auditorischen Sinneszellen und den peripheren Dendriten der primären auditorischen Neurone bilden, geschädigt. Ein bedeutender Aspekt der Pathogenese ist die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Antioxidantien sind eine vielversprechende Wirkstoffgruppe in der Therapie und Prävention von Schalltrauma-induziertem Hörverlust. Allerdings gibt es aktuell kein zugelassenes Medikament für die Prävention von Schalltrauma-induziertem Hörverlust. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Tiermodelles für die Grundlagenforschung zur Entwicklung pharmakologischer Präventionsmethoden. Dabei wurde im ersten Schritt eine histologische Methode entwickelt, die die gleichzeitige Darstellung der Ribbon-Synapsen und eines Cochlea Implantates ermöglicht. Auf diese Weise ist die Methodik auch in anderen Bereichen der Hörforschung einsetzbar. Als zweiter Schritt wurde ein Tiermodell etabliert, das sowohl eine kontinuierliche Wirkstoffapplikation in normalhörende Tiere als auch die Induktion einer temporären Hörschwellenverschiebung ermöglicht. Mit Hilfe dieses Modells wurde der Wachstumsfaktor Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), welcher antioxidative Eigenschaften besitzt, auf sein Potential zur Prävention von Schalltrauma-induziertem Hörverlust bei Langzeitgabe untersucht. Zur Darstellung der komplexen dreidimensionalen Struktur der (implantierten) Meerschweinchen-Cochlea mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie sind „cleared cochleae“, bei denen eine Anpassung des Brechungsindexes erfolgt, die Methode der Wahl. Um zuverlässig die Ribbon-Synapsen darstellen zu können, wurden zwei Präparationsmethoden getestet: vorsichtige Entfernung eines Teiles der knöchernen Kapsel oder Dreiteilung horizontal zur Achse nach erfolgter Entkalkung. Beide Methoden ermöglichen die Darstellung, haben jedoch unterschiedliche Vor- und Nachteile. Ein gemeinsamer Nachteil ist die Tatsache, dass Aufnahmen der Ribbon-Synapsen durch die Größe und Positionierung der Probe, die den Arbeitsabstand und somit die maximale Eindringtiefe der Fokusebene bestimmt, limitiert sind. Da im weiteren Verlauf der Arbeit der Fokus auf den Synapsen in unterschiedlichen Frequenzbereichen und nicht auf der Darstellung des Implantates lag, wurde eine andere Präparation gewählt und die Basilarmembran auf ganzer Länge abpräpariert. Um eine zuverlässige kontinuierliche Wirkstoffapplikation in die Cochlea zu gewährleisten, wurde eine Medikamentengabe mittels osmotischer Minipumpe und angefügtem Hook-Delivery-Device (HDD) entwickelt und getestet. Die Implantation des HDD in normalhörende Tiere führte zu signifikant erhöhten klick- und frequenzspezifischen Hörschwellen. Dennoch war die Induktion einer temporären Hörschwellenverschiebung durch vierstündige Beschallung mit einer modifizierten Aufnahme eines Orchesterstückes möglich. Die Regeneration eine Woche nach der Exposition führt zu einem Unterschied der Lärm-induzierten Hörschwellenverschiebung zwischen implantierten Ohren und kontralateralen Ohren. Dabei zeigen die implantierten Ohren zu diesem Zeitpunkt geringere Hörschwellenverschiebungen. Ursächlich dafür kann zum einen der Effekt der verabreichten artifiziellen Perilymphe und zum anderen die Beeinflussung der cochleären Mechanik durch den HDD sein. Nichtsdestotrotz ist das Tiermodell gut geeignet zur Untersuchung potenziell präventiver Substanzen. Kontinuierliche Applikation von IGF-1 führte im etablierten Tiermodell einer Schalltrauma-induzierten, temporären Hörschwellenverschiebung zu keinem eindeutigen positiven Effekt. In Bezug auf den Lärm-induzierten Hörverlust zeigte sich eine Tendenz zu stärkeren Schädigungen bei den IGF-1 behandelten Tieren. Eine mögliche Erklärung wäre eine schnellere Heilung der Rundfenstermembran nach Implantation und damit ein besseres Wirken des Lärmtraumas. Die kontralateralen Ohren zeigten keinen Unterschied im Vergleich der IGF-1 behandelten und der Kontrolltiere. Histologisch konnten bei Betrachtung der Ribbon-Synapsen in verschiedenen Frequenzbereichen keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier Konditionen (mit / ohne IGF-1; ipsi- und kontralateral) festgestellt werden. Bei Betrachtung des Proteoms der Perilymphe waren in den ipsilateralen Ohren der IGF-1 behandelten Tiere drei Proteine signifikant erhöht im Vergleich zu den ipsilateralen Ohren der Kontrollgruppe. Kontralateral waren im Gruppenvergleich in der IGF-1 Gruppe fünf Proteine erhöht und vier Proteine erniedrigt. Die veränderten Proteine lassen auf einen positiven Einfluss der Behandlung mit IGF-1 schließen. Es ist anzunehmen, dass die in dieser Studie durchgeführte kontinuierliche Applikation von IGF-1 über einen Zeitraum von zwei Wochen zu einer Akkumulation in der Cochlea und im Folgenden zu einer Überdosierung führte. Da in früheren Studien von positiven Effekten einer IGF-1 Behandlung berichtet wird und es auch in der vorliegenden Arbeit Anhaltspunkte für eine positive Wirkung gibt, sollte in folgenden Studien an einer Optimierung der Applikationskinetik gearbeitet werden, um eine Überdosierung zu vermeiden. Die Herausforderung dabei ist die Notwendigkeit eines kontinuierlichen Schutzes und einer, damit einhergehenden, kontinuierlichen Applikation. 

Noise-induced hearing loss represents one of the major causes of sensorineural hearing loss. The triggering noise exposure takes place either in the occupational environment or during leisure time. Both, single severe and multiple exposures, are possible. Due to the unpredictability of the trauma as well as the circumstances of the (work) environment, prevention using conventional hearing protection is not possible in all situations. Therefore, science turns its focus to pharmacological prevention. The pathomechanism underlying the clinical picture is complex. The ribbon synapses, which form the connection between the auditory sensory cells and the peripheral dendrites of the primary auditory neurons, are frequently damaged. A significant aspect of pathogenesis is formation of reactive oxygen species (ROS). Antioxidants are a promising group of agents in the treatment and prevention of noise-induced hearing loss. However, there is currently no approved drug for the prevention of noise-induced hearing loss. The aim of the present thesis was to develop an animal model for basic research on the development of pharmacological prevention methods. In the first step, a histological method was developed that allows simultaneous imaging of the ribbon synapses and a cochlear implant. The developed methodology is applicable to other areas of hearing research as well. As a second step, an animal model was established that allows both continuous drug application in normal-hearing animals and induction of a temporary hearing threshold shift. Using this model, the insulin-like growth factor 1 (IGF-1), which has antioxidant properties, was investigated for its potential to prevent noise-induced hearing loss during long-term administration. For imaging the complex three-dimensional structure of the (implanted) guinea pig cochlea using confocal laser scanning microscopy of "cleared cochleae", in which an adjustment of the refractive index is performed, are the method of choice. In order to reliably image the ribbon synapses, two preparation methods were tested: careful removal of a part of the bony capsule or trisection horizontally to the axis after decalcification have been performed. Both methods allow imaging but have different advantages and disadvantages. A common disadvantage is the limitation of the working distance which is predetermined by the sample size and the positioning of the sample and sometimes hinders the ribbon synapse imaging. Since the focus of the thesis was on the synapse analysis in different frequency ranges after noise insult and drug treatment and not on imaging the implant, a different preparation was chosen, and the basilar membrane was dissected along its entire length and imaged as plane sample using CLSM. To ensure reliable continuous drug delivery into the cochlea, an osmotic minipump and attached hook delivery device (HDD) were developed and tested. Implantation of the HDD in normal-hearing animals resulted in significantly increased click- and frequency-specific hearing thresholds. Nevertheless, induction of a temporary hearing threshold shift was possible by four hours of exposure to a modified recording of an orchestral piece. Regeneration one week after exposure results in a difference in noise-induced hearing threshold shift between implanted ears and contralateral ears. Thereby, the implanted ears show lower hearing threshold shifts at this time point. The reason for this may be the effect of the administered artificial perilymph on the one hand and the influence of the HDD on the cochlear mechanics on the other hand. However, the animal model is a good tool for the investigation of potentially preventive substances. Continuous application of IGF-1 did not lead to a clear positive effect in the established animal model of noise-induced temporary threshold shift. With regard to noise-induced hearing loss, there was a tendency toward more severe damage in the IGF-1-treated animals. A possible explanation would be faster healing of the round window membrane after implantation and thus a better effect of the noise trauma. The contralateral ears showed no difference when comparing the IGF-1 treated and control animals. Histologically, no significant differences were found between the four conditions (with/without IGF-1; ipsi- and contralateral) when the ribbon synapses were examined in different frequency ranges.  Perilymph proteome analysis reports three significantly increased proteins in the ipsilateral ears of IGF-1-treated animals compared with the ipsilateral ears of the control group. On the contralateral side, five proteins were increased and four proteins were decreased in the IGF-1 group compared with the control group. The altered proteins suggest a positive effect of treatment with IGF-1. It can be assumed that the continuous application of IGF-1 over a period of two weeks in this study led to an accumulation in the cochlea and subsequently to an overdose. As previous studies have reported positive effects of IGF-1 treatment and there is evidence for a positive effect in the present work as well, subsequent studies may optimize the release kinetics  to avoid overdosage. The challenge in doing this is the need for continuous application to induce life-long protection.

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