Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Formation of neutrophil extracellular traps under hypoxia and in response to SARS-CoV-2

Neutrophils are part of the innate immune system and usually act as first responders at an infection site, where they must act under altered conditions, due to increased oxygen demand. Low oxygen conditions are called “hypoxia” and can affect cellular behavior. Even under hypoxic conditions, neutrophils have a wide repertoire of antimicrobial actions, as neutrophil extracellular trap (NET) formation where they expel their decondensed DNA, spiked with antimicrobial peptides, into the extracellular space to entrap and kill invading microbes. Thus, NETs and hypoxia were the focus of this work. Evaluation of NET formation on microscopic images is still unstandardized. The first chapter summarizes current techniques and assesses three distinct methods for microscopy to highlight the need to tackle this unsolved issue in NET research. Thereafter, the relation between NET formation, hypoxia and cellular cholesterol content were investigated. Neutrophils from a hypoxia inducible factor (HIF)-1α mouse model and fresh human blood were treated by cholesterol depletion to trigger NET formation. It was found that neither HIF-1α nor the presence of dissolved oxygen were needed for NET formation. These results show that different stimuli can trigger distinct ways of NET formation. The third chapter shows that reduced NET degradation capacities and increased cathelicidin levels in elderly male COVID-19 patients may pose a risk factor, as the peptide is described to stabilize NETs against degradation by host DNases. The fourth chapter describes vesicular NET formation as potential initial neutrophil response against SARS-CoV-2 and its proteins, independent of available oxygen. Increased rates of vesicular NET formation were observed in neutrophils stimulated with viral proteins in vitro as well as neutrophils obtained from infected hamsters at six days post infection. Concluding, this thesis highlights and combines hypoxia and NET formation as key elements in infection research.

Neutrophile sind Teil der angeborenen Immunantwort und meist zuerst an einem Infektionsherd, wo sie unter erschwerten Bedingungen arbeiten, da dort vermehrt Sauerstoff verbraucht wird. Umgebungen mit reduziertem Sauerstoff werden „hypoxisch“ genannt und können Zellen beeinflussen. Selbst unter Hypoxie haben Neutrophile diverse antimikrobielle Antworten wie die Bildung von „neutrophil extracellular traps“ (NETs), wobei sie ihre dekondensierte DNA, besetzt mit antimikrobiellen Peptiten, in den extrazellulären Raum schießen, um Pathogene einzufangen und abzutöten. Der Fokus dieser Arbeit liegt daher auf NETs und Hypoxie. Die Auswertung von NETs auf mikroskopischen Bildern ist bisher nicht standardisiert. Das erste Kapitel fasst aktuelle Techniken zusammen und behandelt drei ausgewählte Methoden zur Auswertung von mikroskopischen Bildern, um den Bedarf zur Lösung dieses Themas zu betonen. Danach wird die Beziehung zwischen NETs, Hypoxie und zellulärem Cholesterolgehalt untersucht. Dazu wurde Cholesterol von Neutrophilen aus einem „hypoxia inducible factor (HIF)-1α” Mausmodel und aus humanem Blut depletiert, um NETs auszulösen. Weder HIF-1α noch gelöster Sauerstoff waren hierfür nötig. Dies belegt, dass verschiedene Stimuli unterschiedliche Wege zur NETs Bildung auslösen. Das dritte Kapitel zeigt das verringerte NETs Degradation und erhöhte Cathelicidinlevel in älteren männlichen COVID-19 Patienten ein Risikofaktor sein können, da das Peptid NETs vor dem Abbau durch wirtseigene DNasen schützt. Im vierten Kapitel wird die vesikuläre Form der NETs Bildung als mögliche initiale Reaktion auf SARS-CoV-2 oder dessen Proteine beschrieben, unabhängig von verfügbarem Sauerstoff. Vermehrte vesikuläre NETs wurden in Neutrophilen beobachtet, die mit viralen Proteinen stimuliert wurden als auch in Neutrophilen aus infizierten Hamstern am sechsten Tag nach Infektion. Zusammengefasst kombiniert diese These Hypoxie und NETs Bildung als wesentliche Elemente der Infektionsforschung.

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