Influence of IGFBP-4 on Bovine Oocyte Quality and Embryonic Developmental Competence in vitro

Camacho de Gutiérrez, Adriana, Raquel

Dissertation 2022 CC BY 4.0

Published

Influence of IGFBP-4 on Bovine Oocyte Quality and Embryonic Developmental Competence in vitro

German
English

Das Insulin-like growth Faktor (IGF) System ist ein komplexes endokrines und parakrin/autokrin wirkendes System mit zwei Liganden: IGF-1 und IGF2, den entsprechenden Rezeptoren und verschiedenen IGF-Bindungsproteinen (IGFBPs) sowie spezifischer Proteasen. Lokal produziertes sowie systemisches IGFs erhöhte in Studien die Kumulusexpansion, wirkt auf Granulosazellen und Eizellen anti-apoptotisch und fördert die Eizellmaturation. Die Zugabe von IGFs während der in vitro Embryoproduktion (IVP) konnte die Entwicklungskompetenz von Eizellen, sowie die Embryoqualität und den sogenannten “Schlüpfen” Prozess verbessern. Jedoch wird die Bioverfügbarkeit von freiem IGFs an der Zelle bzw. am Rezeptor von IGFBPs moduliert. Diese Proteine wirken modulatorisch, da sie IGFs transportieren, die Halbwertzeit verlängern und bei Proteolyse IGFs lokal bioverfügbar wird. Es gibt sechs gut beschriebene IGFBPs, wobei IGFBP-4 vor allem inhibitorische Funktionen hat und die Bindung von IGFs an den IGF1-R blockiert. Bei Kühen konnten hohe IGFBP4 Konzentrationen bereits mit Follikelatresia assoziiert werden. Jedoch ist bislang unklar, ob IGFBP4 auch direkte oder indirekte Effekte auf die Entwicklungskompetenz von bovine Eizellen aufweist. Ziel dieser Studie ist es daher den Effekt von IGFBP-4 auf die in vitro Entwicklungskompetenz von Eizellen und die präimplantative Embryoentwicklung zu untersuchen.

Zunächst wurde die Reinheit des kommerziellen rekombinanten bovine IGFBP-4 mittels Gelelektrophorese getestet. Die Stabilität von IGFBP4 unter in vitro Reifungsbedingungen (in vitro maturation, IVM) sowie die biologische Bindung von IGF-2 wurde mittels Western Ligand Blot geprüft. IGFBP-4 lag in glykolysierter und nicht glykolysierter Form vor. Zudem konnte gezeigt werden, dass IGFBP-4 IGF-2 binden konnte und stabil im IVM Medium blieb.

Die Bestimmung von freiem IGF-2 zeigte, dass rbIGFBP-4 IGF-2 bindet und somit die Verfügbarkeit von IGF am Rezeptor der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) blockiert. Im Hauptexperiment wurde der direkte Effekt von rbIGFBP-4 auf die Entwicklungskompetenz der bovine Eizellen geprüft. KOKs wurden aus Schlachthofovarien gesammelt und in IVM Kulturmedium (basierend auf TCM 199) mit (rbIGFBP-4, 54, 540, and 2,000 ng/ml) und ohne rbIGFBP-4 inkubiert. Nach der in vitro Fertilisation (IVF) und der Entwicklung von Zygoten wurden diese für neun Tage in vitro kultiviert (IVC). Hinsichtlich der Oozytenkompetenz wurde die Expansion, die Kernreifung, Teilungsrate und der “Schlüpfen prozess” an Tag 7, 8 und 9 evaluiert. Hinsichtlich der Embryoqualität wurde die Zellzahl mittels Fluoreszenzfarbstoff (Hoechst) an Tag 7 bestimmt. Um den direkten oder indirekten Effekt von IGFBP-4 auf IGF-1 regulierte Transkripte zu untersuchen, wurden die folgenden Transkripte mittels RT-qPCR an Tag 9 gemessen: SLC2A1, SLCA3, BAX, SOCS2, and STAT 3 sowie POU5F1. Die ermittelten Entwicklungsparameter, Genexpression sowie die Gesamtzellzahl der Embryonen war vergleichbar zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe mit rbIGFBP-4 Zugabe. Interssanterweise konnte aber gezeigt werden, dass in der hohen rbIGFBP-4 Konzentration von 2000 ng/ml die Rate der geschlüpften Embryonen an Tag 8 und 9 geringer war im Vergleich zur Kontrollgruppe (P<0.05).

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass rbIGFBP-4 unter IVM-Bedingungen stabil und biologische Bindungskapazität für IGF-2 aufweist. Die Zugabe von 2000 ng/ml IGFBP4 beeinflusst die “Schlüpfsrate” negativ. Auch wenn wir keinen weiteren Effekt von IGFBP-4 zeigen konnten, eröffnen die Ergebnisse dieser Studie interessante Perspektiven der Rolle von IGFBPs auf die Entwicklung früher Embryonen.

The insulin-like growth factor (IGF) system consists of two ligands: IGF-1 and IGF-2, their respective receptors, the IGF type 1 receptor (IGF-1R) and IGF type 2 receptor (IGF-2R), IGF-binding proteins (IGFBPs) and specific proteases. Locally and systemically produced insulin-like growth factors (IGFs) increase cumulus expansion, protects the granulosa cells and oocytes from apoptosis, and improves oocyte nuclear maturation. Adding IGFs during the in vitro embryo production (IVP) improved oocyte developmental competence, embryo quality, and hatching rates. Nevertheless, IGF bioavailability is substantially modulated through IGFBPs. They exert a regulatory effect on IGF by acting as transporters prolonging their half-life and regulating their bioavailability on the target cells. Insulin-like growth factor binding protein 4 (IGFBP-4) is one of the six IGFBPs. IGFBP-4 mainly inhibits IGFs by hindering the binding of IGFs to their receptors in target cells. Especially in cattle, IGFBP-4 has previously been associated with follicular atresia. However, it is unclear whether IGFBP-4 has a direct (cell receptor interactions) or indirect effect (blocking or stabilizing IGFs) on oocyte developmental competence. Therefore, this study aimed to investigate the influence of IGFBP-4 on in vitro oocyte developmental competence, and its consequent pre-implantation embryo development. For method establishment, recombinant bovine IGFBP-4 (rbIGFPB-4) purity was checked by using gel electrophoresis. Afterwards, the protein stability under in vitro maturation (IVM) conditions using Western Ligand Blot was assessed. Then, binding ability of rbIGFBP-4 to IGF-2 during IVM conditions, was determined by detecting “free” IGF-2 by radioimmunoassay (RIA). The gel electrophoresis analysis detected pure IGFBP-4 in its glycosylated and non-glycosylated form. The Western Ligand Blot analysis showed a biological active protein in stock and working solutions as well as during IVM. Free IGF-2 measurement showed that rbIGFBP-4 bound IGF-2 and by that, impairs IGF-2 utilization by COCs. This binding ability of rbIGFBP-4 increased during the first hours of incubation and decreased after 6 hours during IVM. In the main experiment, we investigated the direct effect of rbIGFBP-4 on oocyte developmental competence. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from abattoir-derived ovaries and set to IVM in dishes containing IVM culture media (TCM 199 based) with or without rbIGFBP-4 (rbIGFBP-4, 54, 540, and 2,000 ng/ml). Afterward, COCs underwent in vitro fertilization (IVF), and presumptive zygotes were in vitro cultured (IVC) for nine days. For oocyte competence: expansion, nuclear maturation, cleavage, and blastocyst and hatching blastocyst rates at days 7, 8 and 9 were evaluated. For embryo quality: the embryo cell counting was determined using a fluorescent dye (Hoechst) in day 7 blastocysts. To investigate an indirect effect of IGFBP-4 on IGF, IGF regulated mRNA transcripts (SLC2A1, SLCA3, BAX, SOCS2, and STAT 3) and a molecular marker for embryo viability (POU5F1) were evaluated in hatching blastocysts at day 8 and in expanded and hatched blastocysts at day 9 by using RT-qPCR. IVP outcomes, gene expression and embryonic total cell counting were comparable between the experimental and control groups. Interestingly, high rbIGFBP-4 concentration (2,000 ng/ml) decreased the hatching and hatched rates of blastocyst at days 8 and 9. This study is the first report on the effect of IGFBP-4 on the hatching ability in bovine embryos. It could be demonstrated that rbIGFBP-4 used in our study was stable under the IVM conditions and biologically active under the IVM conditions. The supplementation with 2,000 ng/ml rbIGFBP-4 during IVM impairs bovine blastocysts' subsequent hatching ability. Although, the rbIGFBP-4 did not affect the total embryonic cell number or the studied gene transcripts, our results open further investigation routes to identify the mechanisms behind the role of IGFBP-4 during COCs maturation and oocyte competence acquisition.