Membrane transport processes and storage stability mechanisms involved in cryopreservation of oocytes and ovarian tissue
Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, die Transportprozesse zu untersuchen, die während der Kryokonservierung von reproduktiven Zellen und Geweben ablaufen, und die Ergebnisse für die rationelle Gestaltung von Kryokonservierungsstrategien zu nutzen. Darüber hinaus wurden die physikalischen Eigenschaften der Konservierungslösungen und ihr Zusammenhang mit der Stabilität der Probenlagerung untersucht. In Kapitel 2 wird das Verhalten von Oozyten während der Kryokonservierung mit Hilfe von theoretischen Wasser/CPA-Transport- und intrazellulären Eisbildungsmodellen prognostiziert. Als Beispiel wurden die Reaktionen von Mausoozyten auf langsames Einfrieren und Vitrifikationstechniken zum Be- und Entladen von CPAs in Form von temperatur- und CPA-abhängigen Veränderungen des Zellvolumens und der intrazellulären CPA-Konzentration gemessen. Um die optimale Abkühlrate für die Kryokonservierung zu ermitteln, wurde die gefrierinduzierte Volumenreaktion von Mausoozyten bei verschiedenen Abkühlraten mit (bzw. ohne) CPA simuliert. Es wurde festgestellt, dass sich die zellulären Reaktionen auf verschiedene CPA-Verbindungen deutlich voneinander unterscheiden. Den Simulationen zufolge führt das Be- und Entladen bei Temperaturen oberhalb der Raumtemperatur (z. B. 37 °C) zu geringeren Volumenänderungen, die die Zelle weniger belasten. Die Prognosen zur osmotischen Reaktion ergaben, dass der osmotische Stress während der CPA-Beladung mit zunehmender CPA-Konzentration anstieg, was durch eine schrittweise Erhöhung der Lösungskonzentration deutlich reduziert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellschrumpfung bei der Entfernung von CPAs einen kritischen Wert erreichen kann, der durch serielle Verdünnung in DMSO-Lösung verhindert werden kann. In Kapitel 3 wurden die Wasserstoffbrückenbindungs-Interaktionen in CPA-Lösungen in H2O und D2O mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie untersucht. Die Auswirkung verschiedener CPA-Typen (Dimethylsulfoxid, Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol, Trehalose) auf schwache und starke Wasserstoffbrückenbindungs-Interaktionen in Lösungen wurde anhand von Infrarotspektren der OH- und OD-Streckungsbanden untersucht. Die PCA ergab, dass verschiedene CPAs anhand ihrer Wirkung auf das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk einer Lösung identifiziert werden können. In Score-Plots ballen sich chemisch ähnliche Moleküle wie GLY und EG zusammen, während Trehalose und DMSO als kondensiert getrennte Cluster erscheinen. Die thermische Ausdehnung von Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerken wurde als allgemeine Verschiebung der OH/OD-Bande zu höheren Wellenzahlen mit zunehmender Temperatur beobachtet, was durch eine Abnahme der Stärke der Wasserstoffbrückenbindung erklärt werden kann. Dieser Effekt ist auf Grund der molekularen Verdrängung bei hohen CPA-Konzentrationen weniger stark ausgeprägt. Die Analyse der thermischen Reaktion von Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerken zeigte, dass sich DMSO-Wasser-Gemische im Vergleich zu anderen CPAs, die OH-Gruppen aufweisen, abweichend verhalten. In dieser Studie wurde auch untersucht, wie CPAs die Bildung von Eiskristallen während der Lagerung beeinflussen und ob dies mit der Lagerstabilität von Liposomen korreliert werden kann. Es wurde festgestellt, dass CPAs das Wachstum von Eiskristallen während der Lagerung verringern und das Auslaufen von Liposomen nach dem Einfrieren verhindern. In Kapitel 4 wurde die FTIR-Spektroskopie als nicht-invasive Technik angewandt, um Veränderungen in der biomolekularen Zusammensetzung und der Struktur in Verbindung mit oxidativem Stress in isolierten Biomolekülen, azellulären Herzklappen und Ovarialkortexgeweben zu bewerten. Mittels PCA wurden die FTIR-Spektralbereiche dieser verschieden behandelten Proben (Fenton- und H2O2-Behandlung oder erhöhte Temperaturen) untersucht, wobei die Score-Plots Kontroll- und geschädigte Proben als separate Gruppen zeigten. Die PCA der FTIR-Spektren von Gewebeproben konnte jedoch auf Grund der Heterogenität des Gewebes und des Vorhandenseins von Wasser keine frühen oxidativen Schäden unter milderen Stressbedingungen erkennen. Mit dem NBT-Assay wurde die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Ovarialgewebeproben bei verschiedenen Temperaturen beobachtet. Es wurde festgestellt, dass das Gewebe vor allem bei Raumtemperatur und 37 °C oxidativem Stress ausgesetzt ist, während dieser bei niedrigeren Temperaturen (d. h. 4 und 25 °C) geringer zu sein scheint.
The central aim of this thesis was to investigate the transport processes that occur during cryopreservation processing of reproductive cells and tissues and to use the findings to rationally design cryopreservation strategies. Furthermore, the physical properties of preservation solutions and their relationship to sample storage stability were studied. In chapter 2, the behavior of oocytes during cryopreservation is predicted using theoretical water/CPA transport and intracellular ice formation models. As example, the reactions of mouse oocytes to slow freezing and vitrification techniques for loading and unloading CPAs were measured in terms of temperature- and CPA-dependent changes in cell volume and intracellular CPA concentration. In order to determine the optimal cooling rate for cryopreservation, the freezing-induced volume response of mouse oocytes was simulated at different cooling rates with(out) CPA. Cellular reactions to several CPA compounds were discovered to differ significantly from one another. According to simulations, loading and unloading at temperatures greater than room temperature (e.g., 37 °C) results in lower volume excursions that put less stress on the cell. The osmotic response predictions revealed higher osmotic stress levels during CPA loading with increasing CPA concentration, which could be significantly reduced when the solution concentration was gradually increased. It was demonstrated that when CPAs are removed, cell shrinkage may also reach a critical value that can be prevented by serial dilution in DMSO solution. In chapter 3, hydrogen bonding interactions in CPA solutions in H2O and D2O were studied using FTIR spectroscopy. The effect of various CPA types (dimethyl sulfoxide, glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, trehalose) on weak and strong hydrogen bonding interactions in solutions was studied using infrared spectra of OH and OD stretching bands. PCA revealed that different CPAs can be identified based on the effect they have on a solution's hydrogen bonding network. In score plots, chemically similar molecules such as GLY and EG cluster together, whereas trehalose and DMSO appear as condensed separated clusters. Thermal expansion in hydrogen bonding networks was seen as an overall shift of the OH/OD band to higher wavenumbers with increasing temperature, which can be explained by a decrease in hydrogen bond strength. Due to the effects of molecular crowding, this impact was found to be less pronounced at high CPA concentrations. Thermal response analysis of hydrogen bonding networks showed that DMSO-water mixtures behave anomalous compared to other CPAs that have OH groups. In this study, it was also examined how CPAs affect the formation of ice crystals during storage and whether this can be correlated with storage stability of liposomes. It was discovered that CPAs reduce the growth of ice crystals during storage and inhibit liposome leakage after freezing. In chapter 4, FTIR spectroscopy was applied as a non-invasive technique to evaluate changes in biomolecular composition and structure, related with oxidative stress in isolated biomolecules, acellular heart valve, and ovarian cortex tissues. PCA was used to examine the FTIR spectral regions of these specimens that had undergone various treatments (Fenton and H2O2 treatment or elevated temperatures), and score plots showed control and damaged samples as separate clusters. PCA of FTIR spectra of tissue samples, however, could not identify early oxidative damage under milder stress conditions due to tissue heterogeneity and the presence of water. The NBT assay was used to observe the production of reactive oxygen species (ROS) in ovarian tissue samples at various temperatures. It was found that tissue is subjected to oxidative stress, particularly at room temperature and at 37 °C, whereas at lower temperatures (i.e., 4 and 25 °C), this appears to be minor.
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