role of flavivirus NS1 proteins in immune recognition and evasionThe

Camarão, António

Published

The role of flavivirus NS1 proteins in immune recognition and evasion

German
English

Die Einschleppung des Gelbfiebers aus Afrika in die Neue Welt im 17. Jahrhundert, die Ausbreitung des Dengue-Virus von seinem wahrscheinlichen Ursprung im asiatisch-pazifischen Raum nach Amerika und Afrika im 20. Jahrhundert, die rasche Verbreitung des West-Nil-Virus (WNV) auf dem amerikanischen Kontinent seit seiner ersten Entdeckung in der westlichen Hemisphäre im Jahr 1999 und in jüngster Zeit die Zika-Virus-Epidemien im pazifischen Raum und in Lateinamerika erinnern daran, auf welch bemerkenswerte Weise scheinbar ruhende Flaviviren aufflammen und sich in der menschlichen Bevölkerung ausbreiten können und das Potenzial haben, schwere Ausbrüche zu verursachen. Flaviviren sind für einige der hochpathogenen Arbovirusinfektionen verantwortlich und stellen eine erhebliche Belastung für die öffentliche Gesundheit und die sozioökonomische Situation dar. Gegenwärtig gibt es nur wenige zugelassene Impfstoffe für den Menschen, und trotz umfangreicher Bemühungen zur Entdeckung von Medikamenten gibt es keine direkten antiviralen Medikamente zur Behandlung von Flavivirusinfektionen. Folglich besteht ein Bedarf an besseren, sichereren und wirksameren prophylaktischen und direkten antiviralen Therapeutika, was ein besseres Verständnis der immunologischen Mechanismen voraussetzt, die bei Flavivirusinfektionen eine Rolle spielen.

Die langjährige Koevolution mit dem Wirt haben Flaviviren befähigt, mehrere Mechanismen zu entwickeln, um frühe angeborene Immunreaktionen des Wirts zu umgehen. Diese vielschichtige Fähigkeit beruht in erster Linie auf der Expression von Nicht-Strukturproteinen, um antivirale Effektorfunktionen zu hemmen. In dieser Studie wird ein neuartiger Mechanismus beschrieben, durch den die sezernierte Form des NS1-Proteins die angeborenen Reaktionen dendritischer Zellen (DCs) moduliert.

In Manuskript I wird gezeigt, dass sezerniertes Flavivirus-NS1 die DC-Reifung durch Hemmung der Produktion von Entzündungszytokinen und der Oberflächenexpression von co-stimulierenden und MHC-Molekülen modulieren kann. Diese Ergebnisse werden durch Daten gestützt, die auf der Transkript- und Proteinebene in zwei verschiedenen Systemen gesammelt wurden. Sezernierte NS1-Proteine des Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV, engl. TBEV) und WNV verändern nachweislich das Transkriptionsprofil muriner DCs nach der Stimulierung, indem sie entzündliche und chemotaktische Mediatoren herunterregulieren, die für die Immunaktivierung und Antigenpräsentation wichtig sind, sowie co-stimulatorische Moleküle, die für optimales T-Zell-Priming erforderlich sind. Die RNA-Sequenzierungsdaten zeigen, dass das sezernierte Flavivirus-NS1 erhebliche Transkriptionsveränderungen hervorruft, die die hemmenden Wirkungen auf die angeborenen Reaktionen der murinen DCs erklären könnten. Anschließend wurde dieser Effekt in primären humanen DCs biologisch validiert. Insbesondere hemmte die Behandlung menschlicher DCs mit Flavivirus NS1 vor der Induktion ihrer Aktivierung die Sekretion eines breiten Spektrums wichtiger Entzündungszytokine und verringerte die Zelloberflächenexpression von DC-Reifungsmarkern.

Manuskript II beschreibt die mögliche Rolle der myeloiden C-Typ Lektinrezeptoren (CLRs) bei der Erkennung von sezerniertem Flavivirus-NS1. Es wurde ein exploratives, unvoreingenommenes Hochdurchsatz-Screening durchgeführt, um neue Interaktionen zwischen CLRs und NS1-Proteinen verschiedener Flaviviren zu identifizieren. Angesichts der Identifizierung mehrerer CLRs, die in vitro die Erkennung von NS1 der Flaviviren vermitteln, wurde die potenzielle funktionelle Beteiligung von CLRs an der NS1-vermittelten Hemmung angeborener Reaktionen durch Stimulierung von murinen DCs aus Wildtyp- (WT) und spezifischen CLR-Knockout- (KO) Mäusen untersucht. Es wurde jedoch keine funktionelle Beteiligung der getesteten CLRs an der Hemmung der DC-Effektor-Funktionen festgestellt. Um den potenziellen Bindungsmechanismus an Flavivirus NS1 weiter zu untersuchen, wurde die CLR-Bindung an das vollständig glykosylierte WT NS1 Protein mit NS1 N-Glykosylierungsmutanten verglichen. Es wurden keine grundsätzlichen Unterschiede in der CLR-Erkennung festgestellt, was darauf hindeutet, dass die in vitro beobachteten Wechselwirkungen glykanunabhängig sind.

Zusammenfassend ist die Aufklärung der Interaktionen zwischen Virus und Wirt besonders wichtig für die Entwicklung wirksamer antiflaviviraler Immuntherapien gegen diese potenziell lebensbedrohlichen Infektionen, insbesondere im Hinblick auf die Mechanismen, die Flaviviren nutzen, um dem Immunsystem des Wirts zu entkommen. Diese Arbeit erweitert unser Wissen über die Strategien zur Umgehung der Immunantwort, die von Flaviviren an der Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort eingesetzt werden. Hier beschreiben wir einen neuartigen Mechanismus der viralen Immunevasion, der durch die sezernierte Form des NS1-Proteins der Flaviviren vermittelt wird und somit ein vielversprechendes Ziel für weitere Studien zur Immunmodulation und zur möglichen Entwicklung antiviraler Medikamente darstellt.

The introduction of yellow fever into the New World from Africa in the 17th century, the spread of dengue from its probable Asia-Pacific origin to the Americas and Africa during the 20th century, the rapid dissemination of West Nile virus (WNV) through the American continent since its first detection in the Western Hemisphere in 1999, and most recently, the Zika virus epidemics in the Pacific and Latin America, serve as reminders of the remarkable manner in which apparently quiescent flaviviruses can flare up and spread in the human population with the potential to cause severe outbreaks. Flaviviruses are responsible for some of the most pathogenic arbovirus infections and are associated with a significant public health and socioeconomic burden. Currently, few licensed vaccines exist for human use, and in spite of extensive drug-discovery efforts, there are no direct antiviral drugs available to treat flavivirus infections. Consequently, there is a need for better, safer and more effective prophylactic and direct antiviral therapeutics, a process that requires a better understanding of the immunological mechanisms involved during flavivirus infections.

Importantly, long-term co-evolution with the host allowed flaviviruses to develop several mechanisms to evade early host innate immune responses, a multifaceted ability that primarily relies on the expression of non-structural proteins to inhibit antiviral effector functions. Herein, a novel flavivirus immune escape mechanism is described, through which the secreted form of NS1 protein modulates the innate responses of dendritic cells (DCs).

In Manuscript I, the capacity for secreted flavivirus NS1 to modulate DC maturation through inhibition of inflammatory cytokine production and surface expression of co-stimulatory/MHC molecules is shown. These findings are supported by data collected at the transcript and protein levels in two distinct systems. Secreted tick-borne encephalitis virus (TBEV) and WNV NS1 are shown to alter the transcriptional profile of murine DCs through downregulation of inflammatory and chemotactic mediatorsimportant for immune activation and antigen presentation, as well as co-stimulatory molecules required for optimal T cell priming. The RNA sequencing data show that secreted flavivirus NS1 induces substantial transcriptional changes that may explain the inhibitory effects on the innate responses of murine DCs. This observation was then biologically validated in primary human DCs. Notably, treatment of human DCs with flavivirus NS1 prior to activation inhibited the secretion of a broad range of key inflammatory cytokines and decreased the cell surface expression of DC maturation markers.

Manuscript II describes the potential role of myeloid C-type lectin receptors (CLRs) in mediating recognition of secreted flavivirus NS1 by DCs. An exploratory unbiased high-throughput screening was carried out in order to identify novel interactions between CLRs and NS1 proteins of different flaviviruses. Following the identification of several candidate receptors mediating in vitro recognition of flavivirus NS1, the potential functional involvement of CLRs in the NS1-mediated inhibition of innate responses was assessed by stimulating wild-type (WT) and specific CLR knockout (KO) murine DCs. However, no functional involvement of the tested CLRs in the inhibition of DC effector functions was identified. To further dissect the potential binding mechanism to flavivirus NS1, CLR binding to the fully-glycosylated WT NS1 was compared to NS1 N-glycosylation mutants. No principal differences in CLR recognition were identified, highlighting that the interactions observed in vitro were glycan-independent.

In sum, elucidation of virus-host interactions is particularly important for the development of effective antiflaviviral immunotherapies against these potentially life-threatening infections, namely concerning evasion mechanisms used by flaviviruses to escape the host immune system. This thesis expands our knowledge of host immune evasion strategies employed by flaviviruses at the interface between innate and adaptive immune responses. Indeed, a novel mechanism of viral immune evasion associated with the secreted form of flavivirus NS1 protein is described, thus representing a promising target for further studies on immunomodulation and possible development of antiviral agents.