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Investigation of factors influencing the antimicrobial activity of porcine neutrophils during bacterial infections

Bacterial infections are still leading to live-threatening diseases in pigs. Neutrophils are important cells from the innate immune response that counteract such infections. They are one of the first cells that transmigrate to the site of infection. Different mechanisms that neutrophils can carry out to eliminate pathogens are known, for example, intracellular elimination by phagocytosis, extracellularly by releasing granules with antimicrobial substances including antimicrobial peptides (AMPs) or by releasing neutrophil extracellular traps (NETs). NETs are web-like extracellular structures constituted of a DNA backbone and decorated with antimicrobial components. When pathogens come into contact with NETs, they are bound, immobilized and eliminated. These NETs can be released in two forms, “suicidal” NETosis and “vital” NETosis. During “suicidal” NETosis, the nucleus decondenses and the antimicrobial components adhere to the DNA. Subsequently, the cell membrane disrupts, and the NETs are released into the extracellular space. During “vital” NETosis, the DNA and the antimicrobial components are packed in vesicles and these vesicles are transported to the cell membrane and are released gradually to the extracellular space.

In this study, several factors that influence the host-pathogen interaction of porcine neutrophils and bacteria were investigated. Especially the interaction with Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp) and Streptococcus suis (S. suis) was studied. A better understanding of the host-pathogen interaction will help to identify targets for therapeutic intervention or to identify risk factors.

As a first step, the influence of whole blood storage (24 hours) on the viability and antimicrobial activity of neutrophils was analyzed and compared to fresh whole blood. Interesting differences were observed between the fresh and stored blood (Chapter 5.1). By measuring cell death markers, an increase of dead cells was observed over time. In addition, fewer neutrophils were isolated from stored blood. Furthermore, neutrophils were isolated and characterized for their cholesterol content, their phagocytic activity, the production of reactive oxygen species (ROS) and the NET formation. A lower amount of cholesterol was observed in the neutrophils isolated from stored blood. Therefore, it is suspected that these cells are more fragile and susceptible to rupture, which means that finally the neutrophils from stored blood have decreased viability. When the neutrophil activity was evaluated, neutrophils isolated from stored blood showed higher transmigration rates, more ROS production, and slightly higher phagocytosis than neutrophils isolated from fresh blood. In addition, a similar NET release from neutrophils isolated from fresh and stored blood was determined. This part of the investigation showed us that although less quantity of neutrophils from stored blood were isolated, these reacted comparably or even showed enhanced antimicrobial activity compared to neutrophils isolated from fresh blood. This demonstrates that neutrophils isolated from stored blood could still be used for certain assays, since they still exhibit antimicrobial activity.

To trigger an extracellular antimicrobial activity, neutrophils can release cathelicidins that belong to the AMPs. However, depending on the bacteria and the surrounding media, different minimum inhibitory concentrations (MICs) are expected. Therefore, the second part of this study (Chapter 5.2) analyzed the MICs of two cathelicidins: human LL-37 and porcine PR-39. The MICs were evaluated for Escherichia coli (E. coli) and S. suis in four different media and compared against the MICs determined in human or porcine cerebrospinal fluid (CSF). The MICs obtained from the recommended media cation-adjusted Mueller–Hinton broth (CA-MHB), did not resemble the MICs obtained in CSF. Nevertheless, the MICs obtained from S. suis in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) supplemented with CA-MHB, were found to be similar to those obtained in CSF. On the other hand, the MICs analyzed in human CSF tested for E. coli, were higher compared to those analyzed in RPMI and showed even higher values than the MICs obtained in CA-MHB. These results demonstrate that culture media used in the experiments can have an influence on the antimicrobial activity. In addition, these results emphasize the importance of using media that resemble clinically relevant conditions in the experiments.

As third step in this study, it was evaluated how the two pathogens A.pp and S. suis could stimulate different forms of NET release and if they induce NETosis by NADPH oxidase- or CD18-dependent mechanisms (Chapter 5.3). Therefore, NET induction was performed in the presence and absence of NET inhibitors for three hours and analyzed by immunofluorescence microscopy. In addition, it was analyzed by transmission electron microscopy how neutrophils release NETs 30 minutes after bacterial infection. A.pp and S. suis were found to stimulate an NADPH oxidase-dependent release of NETs and that A.pp can also partially induce NETs via CD18. Interestingly, by electron microscopy it was observed that both pathogens could induce a vesicular (“vital”) and “suicidal” NET release 30 minutes after bacterial infection. Most strikingly, however, both A.pp and S. suis can induce neutrophils to act in more than one antimicrobial mechanism simultaneously, such as phagocytosis and NETosis. This emphasizes the importance of further studying these multitasking cells and their defense mechanisms.

Stress is known to contribute to the outcome of diseases, as stress can influence the signaling and interactions of various immune cells. Therefore, the fourth part of this study, analyzed the influence of stress hormones (cortisol, epinephrine and norepinephrine) on the antimicrobial activity of neutrophils during A.pp infection (Chapter 5.4). For this, it was first analyzed whether the stress hormones influence the growth of  A.pp,which was not observed However, when the neutrophil activity was evaluated, a higher ROS production and NET release (“suicidal” and “vital” vesicular NETosis) in presence of stress hormones was detected. In addition, an increase in NET formation was observed in neutrophils infected with A.pp and in the presence of cortisol and epinephrine compared to only A.pp infected neutrophils. Interestingly, the growth of A.pp did not decrease, although more NETs were found due to stimulation with cortisol and epinephrine. On the contrary, A.pp increased its survival in the presence of cortisol, epinephrine and neutrophils. As previously reported, A.pp can take advantage of degraded NETs, which could explain this observation. Furthermore, the results of this study give us a hint that stress hormones can boost the growth of A.pp in the host and negatively influence the course of infection with this bacterium. It can be concluded that stress hormones have an influence on the antimicrobial activity of neutrophils and can affect their performance in case of infection.

In summary, this study shows that neutrophils can interact in different ways depending on the pathogen which they face. In addition, neutrophil viability and antimicrobial activity can be influenced by different factors as for example stress hormones. When studying neutrophil biology in vitro or ex vivo, it needs to be considered that various factors in the management of the sample as e.g. storage of the whole blood or the medium may affect the viability and functionality of the isolated cells or of single antimicrobial factors e.g. the AMPs. 

Bakterielle Infektionen führen immer noch zu lebensbedrohlichen Krankheiten bei Schweinen. Neutrophile sind wichtige Zellen der angeborenen Immunantwort, die solchen Infektionen entgegenwirken. Sie gehören zu den ersten Zellen, die zum Ort der Infektion wandern. Es sind verschiedene Mechanismen bekannt, die Neutrophile zur Eliminierung von Krankheitserregern anwenden können, z. B. intrazelluläre Eliminierung durch Phagozytose, extrazelluläre Eliminierung durch Freisetzung von Granula mit antimikrobiellen Substanzen, einschließlich antimikrobieller Peptide (AMP), oder durch Freisetzung ihrer extrazellulären DNA-Netze (Neutrophil extracellular traps = NETs). DNA-Netze sind netzartige extrazelluläre Strukturen, die aus einem DNA-Grundgerüst bestehen und mit antimikrobiellen Komponenten bestückt sind. Wenn Krankheitserreger mit den DNA-Netzen in Kontakt kommen, werden sie gebunden, immobilisiert und eliminiert.

Diese DNA-Netze können in zwei Formen freigesetzt werden, der "suicidalen" NETose und der "vitalen" NETose. Bei der "suicidalen" NETose dekondensiert der Zellkern und die antimikrobiellen Komponenten haften an der DNA. Anschließend platzt die Zellmembran auf und die DNA-Netze werden in den extrazellulären Raum freigesetzt. Bei der "vitalen" NETose sind die DNA und die antimikrobiellen Komponenten in Vesikel verpackt, die zur Zellmembran transportiert und nach und nach in den Extrazellulärraum freigesetzt werden.

In dieser Studie wurden verschiedene Faktoren untersucht, die die Wirt-Pathogen-Interaktion von neutrophilen Granulozyten von Schweinen mit Bakterien beeinflussen. Insbesondere wurde die Interaktion mit Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp) und Streptococcus suis (S. suis) untersucht. Ein besseres Verständnis der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserreger wird dazu beitragen, neue Strategien für therapeutische Maßnahmen zu finden oder Risikofaktoren zu ermitteln.

In einem ersten Schritt wurde der Einfluss der Lagerung von Vollblut (24 Stunden) auf die Lebensfähigkeit und die antimikrobielle Aktivität der Neutrophilen analysiert und mit frischem Vollblut verglichen. Es wurden interessante Unterschiede zwischen frischem und gelagertem Blut beobachtet (Kapitel 5.1). Bei der Messung von Zelltodmarkern wurde im Laufe der Zeit eine Zunahme der toten Zellen festgestellt. Außerdem wurden aus gelagertem Blut weniger Neutrophile isoliert. Darüber hinaus wurden Neutrophile isoliert und auf ihren Cholesteringehalt, ihre phagozytische Aktivität, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die DNA-Netz-Bildung untersucht. Bei den aus gelagertem Blut isolierten Neutrophilen wurde ein geringerer Cholesteringehalt festgestellt. Es wird daher vermutet, dass diese Zellen zerbrechlicher und anfälliger für Rupturen sind, was bedeutet, dass die Neutrophilen aus gelagertem Blut eine geringere Lebensfähigkeit aufweisen. Bei der Bewertung der antimikrobiellen Aktivität von Neutrophilewiesen Neutrophile, die aus gelagertem Blut isoliert wurden, eine höhere Transmigrations Rate, erhöhte ROS-Produktion und eine etwas höhere Phagozytosekapazität auf als Neutrophile, die aus frischem Blut isoliert wurden. Darüber hinaus wurde eine ähnliche DNA-Netz-Freisetzung von Neutrophilen aus frischem und gelagertem Blut festgestellt. Dieser Teil der Untersuchung zeigte uns, dass, obwohl eine geringere Menge an Neutrophilen aus gelagertem Blut isoliert wurde, diese im Vergleich zu Neutrophilen, die aus frischem Blut isoliert wurden, vergleichbar reagierten oder sogar eine erhöhte antimikrobielle Aktivität aufwiesen. Dies zeigt, dass aus gelagertem Blut isolierte Neutrophile für bestimmte Tests verwendet werden können, da sie immer noch eine antimikrobielle Aktivität aufweisen.

Neutrophile können für eine externe antimikrobielle Aktivität Cathelicidine freisetzen, die zu den antimikrobielle PeptideAMP gehören. Je nach Bakterium und Umgebungsmedium sind jedoch unterschiedliche minimale Hemmkonzentrationen (MHKs) zu erwarten. Daher wurden im zweiten Teil dieser Studie (Kapitel 5.2) die MHKs der beiden Cathelicidine LL-37 (Mensch) und PR-39 (Schwein) analysiert. Die MHKs wurden für Escherichia coli (E. coli) und S. suis in vier verschiedenen Medien analysiert und mit den MHKs verglichen, die in Zerebrospinalflüssigkeit von Menschen und Schweinenbestimmt wurden. Die MHKs, die mit dem empfohlenen Medium zur Testung von MHKs bestimmt wurden, der kationenangepassten Mueller-Hinton-Bouillon (CA-MHB), entsprachen nicht den MHKs, die in Zerebrospinalflüssigkeit ermittelt wurde. Die MHKs die für S. suis in Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI), das mit CA-MHB ergänzt wurde, ermittelt wurden, ähneltem jedoch dem von Zerebrospinalflüssigkeit. Andererseits waren die MHKs für E. coli, die in menschlicher Zerebrospinalflüssigkeit bestimmt wurden, im Vergleich zu denen in RPMI höher und zeigten sogar höhere Werte als die in CA-MHB ermittelten MHKs. Diese Ergebnisse zeigen, dass die in den Experimenten verwendeten Kulturmedien einen Einfluss auf die antimikrobielle Aktivität haben können. Darüber hinaus unterstreichen diese Ergebnisse, wie wichtig es ist, in den Experimenten Medien zu verwenden, die klinisch relevanten Bedingungen ähneln.

Als dritter Schritt in dieser Studie wurde untersucht, wie die beiden Erreger A.pp und S. suis verschiedene Formen der DNA-Netz-Freisetzung stimulieren können und ob sie die DNA-Netze durch NADPH-Oxidase- oder CD18-abhängige Mechanismen induzieren (Kapitel 5.3). Daher wurde die DNA-Netz-Induktion in An- und Abwesenheit von DNA-Netz-Inhibitoren für drei Stunden durchgeführt und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert. Darüber hinaus wurde mit dem Transmissions Elektronen Mikroskop untersucht, wie Neutrophile DNA-Netzen 30 Minuten nach Kontakt mit den Erregern frei setzen. Es zeigte sich, dass A.pp und S. suis eine NADPH-Oxidase-abhängige Freisetzung von DNA-Netzen stimulieren und dass A.pp auch teilweise DNA-Netze über CD18 induzieren kann. Interessanterweise wurde mit Hilfe der Elektronenmikroskopie beobachtet, dass beide Erreger 30 Minuten nach dem Kontakt eine vesikuläre („vitale") und „suicidale“ DNA-Netz-Freisetzung induzieren können. Am auffälligsten ist jedoch, dass sowohl A.pp als auch S. suis Neutrophile dazu veranlassen konnten, mehr als einen antimikrobiellen Mechanismus gleichzeitig auszuführen, wie z. B. Phagozytose und DNA-Netz Bildung. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, diese Multitasking-Zellen und ihre Abwehrmechanismen weiter zu untersuchen.

Es ist bekannt, dass Stress zu Krankheiten beitragen kann, da Stress die Signalübertragung und die Interaktionen verschiedener Immunzellen beeinflussen kann. Daher wurde im vierten Teil dieser Studie der Einfluss von Stresshormonen (Cortisol, Epinephrin und Norepinephrin) auf die antimikrobielle Aktivitäten von Neutrophilen bei einer A.pp-Infektion untersucht (Kapitel 5.4). Dazu wurde zunächst analysiert, ob Stresshormone einen Einfluss auf das Wachstum der Bakterien haben und es zeigte sich, dass die Stresshormone keinen Einfluss auf das Wachstum von A.pp haben. Bei der Auswertung der Aktivität von Neutrophilen wurde jedoch eine höhere ROS-Produktion und DNA-Netz-Freisetzung ("suicidal" und „vital“ (vesikulär)) in Gegenwart von Stresshormonen festgestellt. Darüber hinaus wurde eine Zunahme der DNA-Netz-Bildung bei mit A.pp infizierten Neutrophilen und in Gegenwart von Cortisol und Epinephrin beobachtet, verglichen mit nur mit A.pp infizierten Neutrophilen. Interessanterweise nahm das Wachstum von A.pp nicht ab, obwohl mehr DNA-Netze aufgrund der Stimulation durch Cortisol und Epinephrin gebildet wurden. Im Gegenteil, das Überleben von A.pp nahm in Gegenwart von Cortisol, Epinephrin und Neutrophilen zu. Wie bereits berichtet, kann A.pp Bestandteile abgebauter DNA-Netze zur Wachstumsförderung nutzen, was diese Beobachtung erklären könnte. Darüber hinaus geben uns die Ergebnisse dieser Studie einen Hinweis darauf, dass Stresshormone das Wachstum von A.pp im Wirt fördern und das Fortschreiten der Infektion durch dieses Bakterium negativ beeinflussen können. Daraus lässt sich schließen, dass Stresshormone einen Einfluss auf die antimirkobielle Aktivität der Neutrophilen haben und ihre Leistung im Falle einer Infektion beeinträchtigen können.

Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass neutrophile Granulozyten je nach Erreger, mit dem sie konfrontiert sind, auf unterschiedliche Weise interagieren können. Darüber hinaus können die Lebensfähigkeit und die antimikrobielle Aktivität der Neutrophilen durch verschiedene Faktoren wie z. B. Stresshormone beeinflusst werden. Bei der Untersuchung der Biologie der Neutrophilen in vitro oder ex vivo muss berücksichtigt werden, dass verschiedene Faktoren bei der Behandlung der Probe, wie z. B. die Lagerung des Vollbluts oder das verwendete Medium, die Lebensfähigkeit und Funktionalität der isolierten Neutrophilen oder einzelner antimikrobieller Faktoren, z. B. der antimikrobiellen Peptide, beeinflussen können.

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