Assoziation zwischen Bestandteilen des IGF-Systems im Blut und lokal in der Eizellenmikroumgebung (Follikelflüssigkeit) bei Milchkühen
Die somatotrope Achse wirkt sich neben vielen anderen physiologischen Prozessen auch auf die Reproduktion der Milchkuh aus. Diese wird neben endokrinen auch von auto- und parakrinen Faktoren des IGF-Systems am Ovar und im Follikel der Tiere beeinflusst. Als Mediator des Wachstumshormons (GH) ist der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) Bestandteil der somatotropen Achse und des lokalen IGF-Systems. Zu den Zielzellen von IGF-1 zählen dabei unter anderem auch die Zellen im Follikel. Hier steigert IGF-1 die Proliferation und Differenzierung von Granulosa- und Thekazellen und die Sensibilität gegenüber Gonadotropinen. Diese Auswirkungen sind davon abhängig, wie viel freies IGF-1 an den IGF-1 Rezeptor (IGF1R) auf der Zelloberfläche binden kann. Durch 6 hochaffine Bindungsproteine (IGFBP-1 bis 6) wird die Bindung an den Rezeptor moduliert. Die IGFBP binden IGF-1 und hemmen so dessen endokrine Wirkung im Blut der Tiere ebenso wie die parakrine im Follikel selbst. Durch die Proteolyse der Bindungsproteine wird IGF-1 freigesetzt und kann an den IGF1R binden. Inwieweit systemische Veränderungen der somatotropen Achse mit der Veränderung von IGF-1 und IGFBP im Follikel einhergehen, die sich dann auch auf die Follikelreifung und damit die Fertilität auswirken, ist bisher in wenigen Studien systematisch untersucht worden. Auch der mögliche endokrine Transfer über die Filtration von IGF-1 und IGFBP aus dem Plasma in die Follikelflüssigkeit (FF) und die gleichzeitige lokale Regulation des IGF-Systems über parakrine Produktion, wurden nur vereinzelt detaillierter untersucht. Beides ist jedoch zum Beispiel dann relevant, wenn es um die Auswirkungen der Stoffwechselsituation der laktierenden Milchkuh auf ihre Reproduktionsleistung geht. Bei einer Übertragung der hier auftretenden Veränderungen der somatotropen Achse auf das IGF-System hat auch die metabolische Situation einen indirekten Einfluss auf den Follikel und die Eizelle. Daraus ergibt sich die Hypothese dieser Studie, dass IGF-1 in Blut und Follikelflüssigkeit miteinander assoziiert werden können, sie jedoch durch Unterschiede in der lokalen Synthese und Proteolyse von IGFBPs reguliert werden. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden im Tierversuch Blutproben von 78 Milchkühen 30±2 Tage p.p. und 50±3 Tage p.p. genommen und bei 17 dieser Tiere nach Zyklussynchronisation mit zweimaliger Injektion von PGF2α, im Abstand von 14 Tagen, 27 Follikel punktiert und die Follikelflüssigkeit (FF) aspiriert. Zusätzlich standen Plasmaproben und die gepoolte FF einer Probenkohorte aus 25 weiteren Tieren zur Verfügung. Im Blut wurde die Konzentration von BHB, IGF-1, IGFBP-2, -3, -4, -5 und eines IGFBP-Fragments (IGFBP-F) bestimmt. In der FF wurde die Konzentration von IGF-1, IGFBP-2, -3, -4, -5 und IGFBP-F gemessen. Bei der Follikelpunktion konnten Granulosazellen aus 6 Follikeln gewonnen werden, in denen die mRNA-Expression für IGFBP-2, -4, die IGFBP-Protease PAPP-A und des IGF1R bestimmt wurde. So konnte diese Studie zeigen, dass BHB mit IGF-1 im Blut am Tag 30±2 p.p. und in der FF negativ korrelierte (Plasma: r= -0,26, r² = 0,05, P<0.05; FF: r =-0,35; r²=0,15; P<0,05). Ebenso korrelierten IGFBP-3 und -5 sowie die IGFBP-Gesamtkonzentration im Plasma negativ mit BHB im Serum (IGFBP-3: r=-0,64; r²=0,40; P=0,006; IGFBP-5: r=-0,49, P<0,05; IGFBP-Gesamt: r=-0,52, r² 0,27, P<0,05). In dieser Studie bestanden für IGF-1 und die Konzentration der einzelnen IGFBP keine Unterschiede abhängig vom Durchmesser der Follikel. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass mit steigendem Follikeldurchmesser der Anteil an IGFBP-3 zu- und der von IGFBP-4 abnahm (IGFBP-3: r=0,48; r²=0,23; IGFBP-4: r=-0,47; r²=0,22; P<0,05). Zusätzlich war in dieser Studie die Plasmakonzentration von IGF-1 bei Tieren höher, die an Tag 30 ±2 p.p. eine zystische Veränderung auf ihrem Ovar zeigten als bei Tieren ohne eine solche Veränderung. In Plasma und FF korrelierten die Konzentrationen von IGF-1 miteinander, ebenso wie die von IGFBP-2 (IGF-1: r=0,57; r²=0,32; P<0,001; IGFBP-2: r=-0,57; P<0,05). Im Blut war der Anteil von IGFBP-2 an der Gesamtkonzentration der IGFBP höher als in der FF. Für das IGFBP-F und IGFBP-5 war der Anteil in der FF höher. Die relative Genexpression war für IGFBP-4 in den präovulatorischen Follikeln geringer als in kleineren Follikeln. Für IGFBP-2 korrelierte die mRNA-Expression negativ mit der Konzentration von IGF-1 im Follikel und für die mRNA des IGF1R positiv mit der Konzentration des IGFBP-F in der FF. Diese Studie konnte also zeigen, dass für IGF-1 und IGFBP-2 ein Transfer zwischen somatotroper Achse und IGF-System im Follikel besteht. Dabei werden IGF-1 in Blut und FF und IGFBP-3, -5 und die Gesamtkonzentration der IGFBP von der Stoffwechselsituation beeinflusst. Die Ergebnisse der Arbeit deuten weiter darauf hin, dass IGFBP-3 im Follikel eine Speicherfunktion im IGF-System übernimmt, während IGFBP-2 sowohl endokrin übertragen als auch abhängig von IGF-1 parakrin produziert wird. IGFBP-4 wird im Zusammenhang mit der Follikelgröße lokal unterschiedlich stark synthetisiert. Das lokal auf den Follikel und die Eizelle wirkende IGF-System hat seinen Ursprung demnach zu Teilen im Transfer und Transport der Bestandteile der endokrinen somatotropen Achse über Filtration aus dem Plasma in den Follikel. Welche Bedeutung der Transfer von endokrinem IGF-1 in die Follikel auf die Eizellentwicklungskompetenz bzw. die nachfolgende Fruchtbarkeit der Milchkuh hat, bleibt in weiteren Studien gezielt zu untersuchen.
The somatotropic axis is an endocrine regulatory circuit with many physiological process, including regulating reproduction in the dairy cow. At the same time fertility is influenced not only by endocrine factors, but also by auto- and paracrine factors at the ovarian and follicular level. The latter is where the IGF system controls follicular maturation and selection and influences the developmental competence of the oocyte. Part of the systemically acting somatotropic axis is insulin-like growth factor 1 (IGF-1) as a mediator of growth hormone (GH). IGF-1 is part of endocrine regulation via blood circulation, but also has auto- and paracrine effects, where it acts directly on cells as part of the IGF system. The target cells of the growth factor also include cells in the follicle: IGF-1 increases the proliferation and differentiation of granulosa and theca cells and the sensitivity against gonadotropins. These effects depend on how much free IGF-1 can bind to the IGF-1 receptor (IGF1R) on the cell surface. Through six high-affinity binding proteins (IGFBP-1 to 6), which are further components of the IGF system, this receptor binding is additionally regulated. The IGFBPs bind IGF-1 and thus inhibit its endocrine action in the animals' blood and the paracrine action in the follicle. Proteolysis of the binding proteins releases IGF-1 again and allows it to bind to the IGF1R. Very few studies to date have described the extent to which systemic changes in the somatotropic axis are associated with alterations in IGF-1 and IGFBP in the follicle, which then also affect follicular maturation and thus fertility. Additionally, only a few studies have described in more detail a possible endocrine transfer via filtration of IGF-1 and IGFBP from plasma into the follicular fluid (FF) and the simultaneous local regulation of the IGF system via paracrine production. However, both are relevant, for example, when considering the effects of the metabolic situation of the lactating dairy cow on her reproductive performance. If the changes of the somatotropic axis occurring here are transferred to the IGF system, the metabolic status of the cow may have an indirect influence on the follicle and the oocyte. This leads to the hypothesis of this study: that IGF-1 in blood and follicular fluid can be associated with each other but are regulated by differences in local synthesis and proteolysis of IGFBPs. To test this hypothesis, blood samples were taken from 78 dairy cows 30±2 days postpartum (p.p.) and 50±3 days p.p. in animal experiments, and 27 follicles were punctured. Follicular fluid (FF) of these follicles was aspirated in 17 of these animals after cycle synchronization with two injections of PGF2α, 14-days apart. In addition, plasma samples and pooled FF from a sample cohort of 25 other animals were available for analysis. The concentration of BHB, IGF-1, IGFBP-2, -3, -4, -5, and an IGFBP fragment (IGFBP-F) in blood were determined. In FF, the concentration of IGF-1, IGFBP-2, -3, -4, -5, and IGFBP-F was measured. Follicle puncture allowed granulosa cells to be obtained from 6 follicles, in which the expression of mRNA for IGFBP-2, -4, the IGFBP protease PAPP-A, and IGF1R was determined. The results of this study demonstrated that BHB correlated negatively with IGF-1 in blood at day 30±2 p.p. and in FF (plasma: r= -0.26, r²=0.05, P<0.05; FF: r=-0.35; r²=0.15; P<0.05). Also, IGFBP-3, IGFBP-5 and total plasma IGFBP concentration correlated negatively with serum BHB (IGFBP-3: r=-0.64; r²=0.40; P=0.006; IGFBP-5: r=-0.49, P<0.05; total IGFBP: r=-0.52, r² 0.27, P<0.05). In this study, there were no differences for IGF-1 and the concentration of each IGFBP depending on the diameter of the follicle. However, we observed that with increasing follicle diameter, the proportion of IGFBP-3 increased and that of IGFBP-4 decreased (IGFBP-3: r=0.48; r²=0.23; IGFBP-4: r=-0.47; r²=0.22; P<0.05). In addition, the plasma concentration of IGF-1 was higher in animals that showed cysts on their ovary at day 30±2 p.p. than in animals without ovarian pathologies. In plasma and FF, the concentrations of IGF-1 correlated with each other, as did those of IGFBP-2 (IGF-1: r=0.57; r²=0.32; P<0.001; IGFBP-2: r=-0.57; P<0.05). In blood, the proportion of IGFBP-2 to total IGFBP concentration was higher than in FF. For IGFBP-F and IGFBP-5, the percentage was higher in FF than in plasma. Relative gene expression was lower for IGFBP-4 mRNA in preovulatory follicles than in smaller follicles. There was a negative correlation between IGFBP-2 mRNA-expression and the concentration of IGF-1 in the follicle. IGF1R-mRNA and the IGFBP-F concentration were positively correlated in FF. In conclusion, this study demonstrated that for IGF-1 and IGFBP-2 there is a transfer between the somatotropic axis and the IGF system at the follicular level. Meanwhile, the metabolic status of the cow influences IGF-1 both in blood and FF and systemic IGFBP-3, -5 and the total concentration of IGFBP. The results of the study further suggest that IGFBP-3 in the follicle performs a reservoir function in the IGF system, whereas IGFBP-2 is both endocrine-transmitted and paracrine-produced depending on IGF-1. IGFBP-4 is differentially synthesized locally in relation to follicle size. Thus, the IGF system acting locally on the follicle and the oocyte has its origin in part in the transfer and transport of the components of the endocrine somatotropic axis via filtration from the plasma into the follicle. The significance of the transfer of endocrine IGF-1 into the follicles on oocyte development competence or subsequent fertility of the dairy cow remains to be specifically investigated in further studies.
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