Generation of KCNJ5 G151R/+ Knock-in Pigs as a Model for Human Primary Aldosteronism Using the CRISPR/Cas9 System

Lenk, Laura, Johanna

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Generation of KCNJ5 G151R/+ Knock-in Pigs as a Model for Human Primary Aldosteronism Using the CRISPR/Cas9 System

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Primärer Hyperaldosteronismus (PA), die autonome und übermäßige Produktion des Mineralokortikoids Aldosteron, gilt als die häufigste Ursache für sekundären Bluthochdruck. Im Vergleich zu Patienten mit Bluthochdruck anderer Ätiologien ist der primäre Hyperaldosteronismus mit einer höheren Inzidenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Nierenschäden verbunden. Die beiden häufigsten Ursachen für PA sind bilateraler Hyperaldosteronismus und Aldosteron produzierende Adenome (APA). Etwa 40 % aller APAs lassen sich auf zwei heterozygote somatische Mutationen im KCNJ5 Gen (G151R, L168R) zurückführen. Erbliche Formen von PA sind beschrieben, aber selten. PA wird nur selten diagnostiziert, und die Diagnostik umfasst mehrere Schritte, einschließlich Bestätigungstests und invasiver Katheterisierung der Nebennierenvenen, um zwischen einseitiger und beidseitiger Erkrankung zu unterscheiden, die nur in spezialisierten Zentren zur Verfügung steht. Bei einseitiger Erkrankung normalisiert die Adrenalektomie in der Regel den Aldosteron/Renin-Quotienten und korrigiert die Hypokaliämie, was den Blutdruck häufig deutlich senken kann. Die Standardtherapie für bilaterale Erkrankungen sind Mineralokortikoid-Rezeptorantagonisten, deren Anwendung allerdings mit schweren Nebenwirkungen verbunden sein kann. Als neue diagnostische und therapeutische Strategien für Patienten mit KCNJ5 Mutationen wurden spezifische Inhibitoren der mutierten Kaliumkanäle vorgeschlagen, die nicht mit den Wildtyp Kanälen interagieren, wie Makrolidantibiotika, zum Beispiel Roxithromycin. Bislang gibt es kein geeignetes Tiermodell für grundlegende Studien, um das Potenzial von Makroliden und ihren Derivaten ohne antibiotische Wirkung für die Diagnose und Therapie von PA zu untersuchen.
In diesem Projekt haben wir Genom Editierung eingesetzt, um ein neues Schweinemodell für PA zu erzeugen. Wir haben das CRISPR/Cas9 System sowie Prime Editor (PE) erfolgreich verwendet, um die KCNJ5 G151R Mutation in Fibroblasten vom Schwein zu integrieren. Die Editierungseffizienz wurde mit dPCR ermittelt, und beide Ansätze zeigten einen ähnlichen Prozentsatz an erfolgreich editierten Zellen (CRISPR/Cas9 5,46 %, PE 5,19 %). Darüber hinaus wurden Zellklone mit heterozygotem KCNJ5^G151R/+ Genotyp aus beiden Ansätzen für den somatischen Zellkerntransfer (SCNT) verwendet und zeigten vergleichbare Blastozystenraten (CRISPR/Cas9 12 %, PE 12 %), was das große Potenzial von PE für die Genom Editierung bei Schweinen unterstreicht, das bisher noch nicht beschrieben wurde. Außerdem führten wir Embryotransfers durch und erzeugten vier männliche Knock-in Schweine (KI) mit heterozygoter G151R Mutation. Im Alter von 23 Wochen wurde bei den KI Schweinen im Vergleich mit alters- und geschlechtsgleichen, nicht verwandten Wildtyp Schweinen (WT) ein signifikant erhöhter Aldosteron/Renin-Quotient, ein wichtiger Screening Parameter für PA, festgestellt (KI 1,17 ± 0,41, WT 0,48 ± 0,14, p < 0,05, zweiseitiger Welch's Test, n = 4). Nicht-invasive oszillometrische Blutdruck- und Herzfrequenzmessungen mit Blutdruckmanschetten am Schwanz ergaben eine konstant erhöhte Herzfrequenz bei den KI Schweinen und einen Trend zu erhöhtem Blutdruck, jedoch mit hoher intra- und interindividueller Variabilität. Die immunhistologische Färbung der Nebennieren von verstorbenen Ferkeln zeigte eine reduzierte KCNJ5 Färbung und erste Anzeichen einer sich entwickelnden Hyperplasie. Diese ersten Daten der Phänotypisierung unter-streichen das Potenzial von KCNJ5^G151R/+ KI Schweinen für die Forschung zur Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Ansätze bei primären Hyperaldosteronismus.

Primary aldosteronism (PA), the autonomous and excessive production of the mineralocorticoid aldosterone, is considered to be the most common cause of secondary hypertension. Compared with hypertensive patients with other etiologies, primary aldosteronism is associated with a higher incidence of cardiovascular diseases and renal injury. The two most common causes of PA are bilateral hyperaldosteronism and aldosterone-producing adenomas (APAs). Approximately 40 % of all APAs can be traced back to two heterozygous somatic mutations in the KCNJ5 gene (G151R, L168R). Mendelian forms of PA have been described but occur only rarely. PA is underdiagnosed. Its diagnosis requires multiple steps, including confirmatory testing and invasive adrenal venous sampling, only available in specialized tertiary care centers, to differntiate between unilateral and bilateral disease forms. For unilateral disease, adrenalectomy usually normalizes aldosterone:renin ratios and corrects hypokalemia. Often, blood pressure can be reduced significantly. The standard medical therapy for bilateral disease is mineralocorticoid receptor antagonists, which are associated with severe side effects. Specific inhibitors of mutant potassium channels that do not interact with wild type channels, like macrolide antibiotics such as roxithromycin, have been proposed as a new diagnostic and/or therapeutic strategy for patients with KCNJ5 mutations. So far, no animal model has been established for fundamental studies investigating the potential of macrolides and their derivatives without antibiotic effect in the diagnosis and therapy of PA.
In this project, we used genome editing to generate a unique pig model for PA. We successfully used the CRISPR/Cas9 system as well as prime editing (PE) to integrate the KCNJ5 G151R mutation into porcine fibroblasts. Editing efficiencies were determined with dPCR, and both approaches showed similar percentages of successfully edited cells (CRISPR/Cas9 5.46 %, PE 5.19 %). Additionally, cell clones with a heterozygous KCNJ5^G151R/+ genotype from both approaches were used for somatic cell nu-clear transfer (SCNT) with similar blastocyst rates (CRISPR/Cas9 12 %, PE 12 %), highlighting the potential of PE in genome editing in pigs, which has not been previously described. Finally, we performed embryo transfers and generated four male knock-in (KI) pigs with a heterozygous G151R mutation. At 23 weeks of age, a significantly elevated aldosterone:renin ratio (ARR), a screening parameter for PA, was detected in the KI pigs compared with age- and sex-matched non-related wild type pigs (WT) (KI 1.17 ± 0.41, WT 0.48 ± 0.14, p < 0.05, two-tailed Welch’s test, n = 4). Non-invasive tail-cuff oscillometric blood pressure and heart rate measurements recorded elevated heart rates in the KI pigs and a trend of elevated blood pressure but with high intra- und interindividual variability. Immunohistological staining of adrenal glands of deceased piglets revealed a reduced KCNJ5 staining and first signs of developing hyperplasia. These first phenotyping data highlight the potential of KCNJ5^G151R/+ KI pigs for important fundamental studies to establish new diagnostic and therapeutic approaches in PA.