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Equine Metabolic Syndrome : Glucose and lipid metabolism in metabolically and endocrinologically diseased horses

Insulin dysregulation (ID) is the central feature of the equine metabolic syndrome (EMS), a severe endocrinopathic condition affecting equids. The term ID encompasses different aspects of disturbances in insulin regulation. These disturbances include a basal or a pathological high postprandial hyperinsulinemia (HI) and/or peripheral insulin resistance (IR). In consequence, horses develop HI, which is linked to an increased risk of developing endocrinopathic laminitis. Laminitis describes a painful, inflammatory condition inside the hoof capsule, affecting the keratinized epidermis and the laminae of the dermis. The underlying pathomechanisms for the development of ID are still not fully understood, but previous research indicates a contribution of gastrointestinally released incretin hormones in the pathogenesis of ID. Furthermore, alterations of insulin signaling, as seen in human type II diabetes mellitus, might be associated with the development of ID. Due to the increased risk of horses suffering from ID to develop laminitis and consequently animal welfare considerations, reliable and accurate testing methods to detect ID are mandatory. Amongst them, basal or dynamic diagnostic tests are available. However, due to the complexity of disturbances in the insulin homeostasis, the clinical reliability and feasibility of basal and intravenous tests in comparison to oral challenge test remains questionable.

The objective of this PhD project was to determine key proteins of the insulin signaling cascade (ISC) and their degree of phosphorylation in insulin dysregulated (ID) and normoinsulinemic (NON-ID) horses under basal conditions and after an oral glucose and intravenous (IV) insulin challenge. Secondly, the insulin and glucose response to an IV insulin and oral glucose challenge was described to assess the clinical reliability of a modified 2-step insulin response test (2-step IRT) in detecting ID.

In part one, protein expression levels as well as the extent of phosphorylation of four different key proteins of the ISC were investigated. Horses were defined as ID or NON-ID by an oral glucose test (OGT). To identify the responsiveness of single proteins, an in vivo challenge with orally applied glucose and an IV injection of porcine zinc insulin was performed in Icelandic horses. Glucose administration resulted in endogenous HI and hyperglycemia in all horses. Intravenous porcine zinc insulin administration resulted in HI with concurrent euglycemia. Oral glucose and IV insulin stimulation induced phosphorylation of the insulin receptor β (InsR) in liver tissue (LT) and adipose tissue (AT), but not in muscle tissue (MT). Furthermore, InsR phosphorylation was higher in ID compared to NON-ID horses. In LT, phosphorylation of adenosine monophosphate protein kinase α was reduced after glucose administration; however, remained unaffected after IV insulin administration. Phosphorylation of protein kinase B was enhanced after oral glucose stimulation in all tissues but following IV insulin administration only in MT and AT. Interestingly, the mechanistic target of rapamycin (mTOR) was strongly affected by the endocrine status of the Icelandic horses. In LT, the extent of phosphorylation of mTOR was higher in ID horses at baseline conditions and decreased after stimulation with oral glucose, while NON-ID horses showed an inverse pattern. Furthermore, ID horses showed a higher expression of phosphorylated mTOR compared to NON-ID horses in MT, although stimulation was ineffective. In conclusion, tissue-related insulin responsiveness was generally maintained in ID horses. However, the hyper-activation of the InsR in ID horses was not equally transferred to the post-receptor cascade. The higher mTOR phosphorylation in ID horses, already observed under baseline conditions, further indicates that alterations of the protein metabolism might play a crucial role in the pathogenesis of ID independently of insulin. Due to the regulatory role of mTOR on innate immune cell function, ID might additionally be the result of a pro-inflammatory condition.

In the second part of this research project, the diagnostic reliability of a 2-step IRT, performed with a veterinary licensed porcine zinc insulin was assessed and compared to an OGT. The OGT was set as the reference, as this test mimics glucose and insulin dynamics following oral intake of carbohydrates and thus, can detect ID in a direct or indirect manner. The 2-step IRT was developed to detect IR under clinical settings and is still recommended to also detect ID in horses. However, IR is only one aspect of ID and the reliability of IV tests remains questionable with regard to identify horses at risk for developing endocrinopathic laminitis. The results of the present study showed similar glucose dynamics of ID and NON-ID horses during the first 30 minutes of the 2-step IRT. Additionally, no differences of the percentage decline at time point 30 minutes compared to baseline glucose concentrations between horses could be observed. This indicated a comparable insulin-mediated glucose uptake into insulin-sensitive tissues in all horses. In conclusion, sole testing for IR failed to reliably diagnose ID. In consequence, oral testing protocols should be the first choice for assessment of ID, as these tests reflect different aspects of disturbances of insulin regulation.

Overall, our results provided new insights into the pathogenesis of ID and mitigated the potential role of a reduced peripheral IS. Insulin dysregulation is an equine-specific metabolic condition, which is not comparable to human insulin resistance in the context of type II diabetes mellitus. Based on our results, alterations of the protein metabolism might play a crucial role in the development of ID, but future studies are necessary to support and elucidate these hypotheses.

Insulin-Dysregulation (ID) ist der zentrale Aspekt des Equinen Metabolischen Syndroms (EMS). Der Begriff ID fasst verschiedene Störungen der Insulinregulation zusammen. Zu diesen Störungen gehören eine basale oder pathologisch hohe postprandiale Hyperinsulinämie (HI) sowie eine periphere Insulinresistenz (IR). Die daraus resultierende HI geht mit einem erhöhten Risiko, eine endokrinopathische Hufrehe zu entwickeln, einher. Der Begriff Hufrehe beschreibt einen schmerzhaften, entzündlichen Zustand innerhalb der Hufkapsel, der die keratinisierte Epidermis und die Laminae der Dermis betrifft. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen der ID sind noch immer nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass Inkretine, Hormone des Magen-Darm-Traktes, eine Rolle in der Pathogenese einer ID spielen. Darüber hinaus könnten Veränderungen der Insulinsignalkaskade (ISK), wie sie bei Diabetes mellitus Typ 2 des Menschen zu beobachten sind, mit der Entwicklung einer ID zusammenhängen. Aufgrund des erhöhten Risikos Insulin-dysregulierter Pferde eine Hufrehe zu entwickeln, sind zuverlässige und genaue Testmethoden zum Nachweis von ID unerlässlich. Zur Verfügung stehen sowohl basale als auch dynamische Testverfahren. Aufgrund der Komplexität der Störungen der Insulinhomöostase ist die klinische Zuverlässigkeit und Durchführbarkeit von basalen und intravenösen Tests im Vergleich zu oralen Tests jedoch fraglich.

Ziel dieses Forschungsprojekts war es, Schlüsselproteine der ISK sowie deren Phosphorylierungsgrad bei insulin-dysregulierten (ID) und normoinsulinämischen (NON-ID) Pferden unter basalen Bedingungen und nach Stimulation mit oraler Glukose und intravenös verabreichtem Insulin zu untersuchen. Zusätzlich wurde die Insulin- und Glukoseantwort auf eine intravenöse Insulin- und eine orale Glukosestimulation beschrieben, um die klinische Anwendbarkeit eines modifizierten 2-Stufen-Insulinstimulationstests (2-step IRT) zu untersuchen.

Im ersten Teil der Studie wurden die totale Proteinexpression und das Ausmaß der Phosphorylierung von vier verschiedenen Schlüsselproteinen der ISK untersucht. Basierend auf den Ergebnissen des oralen Glukose Tests (OGT) wurden die Islandpferde hierfür in zwei Gruppen, ID und NON-ID, unterteilt. Alle Pferde wurden in vivo mit oraler Glukose und intravenös verabreichtem porzinen Zinkinsulin stimuliert. Die Verabreichung von Glukose führte bei allen Pferden zu einer Hyperglykämie mit endogener Hyperinsulinämie. Die intravenöse Verabreichung von Insulin führte zu einer exogenen Hyperinsulinämie bei gleichzeitiger Euglykämie. Beide Stimulationen induzierten die Phosphorylierung des Insulinrezeptors β (InsR) im Leber- und Fettgewebe, aber nicht im Muskelgewebe. Die Stimulierung des InsR war dabei höher in ID Pferden. Im Lebergewebe konnte außerdem eine physiologische Abnahme der Phosphorylierung der AMP-aktivierten Proteinkinase α (AMPK α) nach Verabreichung von Glukose gezeigt werden. Die Phosphorylierung der Protein Kinase B (PKB/Akt) war nach oraler Glukosestimulation in allen Geweben erhöht, nach intravenöser Insulingabe jedoch nur in Muskel- und Fettgewebe. Interessanterweise konnte in besonderem Maße ein Unterschied in der Expression des „mechanistic Target of Rapamycin“ (mTOR) bei ID Pferden gezeigt werden. Im Lebergewebe zeigten ID Pferde unter basalen Bedingungen einen höheren Phosphorylierungsgrad als NON-ID Pferde. Der Phosphorylierungsgrad nahm nach oraler Glukosestimulation ab, wobei diese Abnahme im Vergleich zur basalen Expression bei ID und NON-ID Pferden umgekehrt war. Darüber hinaus zeigten ID Pferde im Vergleich zu NON-ID Pferden unter basalen Bedingungen eine höhere Expression von phosphoryliertem mTOR im Muskelgewebe. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der komplexe Ablauf der ISK auch in ID Pferden erhalten ist. Nichtsdestotrotz konnten gewebe- und stimulationsbedingte Unterschiede aufgezeigt werden. Die Hyperaktivierung des InsR bei ID Pferden wurde nicht in gleichem Maße auf die Post-Rezeptor-Kaskade übertragen, was durch eine möglicherweise geringere Rezeptorempfindlichkeit erklärt werden kann. Die höhere mTOR-Phosphorylierung bei ID-Pferden, die bereits unter basalen Bedingungen beobachtet wurde, deutet außerdem darauf hin, dass Veränderungen des Proteinstoffwechsels, unabhängig von Insulin, eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von ID spielen könnten. Aufgrund der regulativen Rolle von mTOR für die Funktion angeborener Immunzellen könnte ID zusätzlich das Ergebnis eines pro-inflammatorischen Zustands sein.

Im zweiten Teil dieser Untersuchung wurde die diagnostische Zuverlässigkeit eines modifizierten 2-step IRT bewertet und mit einem OGT verglichen. Der 2-step IRT wurde hierfür mit einem in der Veterinärmedizin zugelassenen porzinen Zinkinsulin durchgeführt. Der OGT wurde als Referenztest festgelegt, da dieser Test die Glukose- und Insulindynamik nach oraler Aufnahme von Kohlenhydraten nachahmt und somit eine ID auf direkte oder indirekte Weise nachweisen kann. Außerdem kann durch orale Testverfahren die vermutete Beteiligung von Inkretinen und folglich einer erhöhten pankreatischen Insulinproduktion simuliert werden. Der 2-step IRT wurde zum Nachweis von IR unter klinischen Bedingungen entwickelt und wird auch zur Diagnostik einer ID empfohlen. Insulinresistenz ist jedoch nur ein Aspekt von ID, und die Zuverlässigkeit eines solchen Tests bleibt fraglich, wenn es darum geht, Pferde mit einem Risiko für die Entwicklung einer endokrinopathischen Hufrehe zu identifizieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigten eine ähnliche Glukosereduktion bei ID und NON-ID Pferden innerhalb der ersten 30 Minuten des 2-step IRT. Darüber hinaus konnten keine Unterschiede in der prozentualen Abnahme der Glukosekonzentration, zum Zeitpunkt 30 Minuten im Vergleich zum Ausgangswert, zwischen den ID und NON-ID Pferden festgestellt werden. Dies deutet auf eine vergleichbare insulinvermittelte Glukoseaufnahme in insulinempfindliche Gewebe bei allen Pferden hin.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass bei ID Pferden der physiologische Ablauf der ISK grundsätzlich erhalten ist und damit keine eindeutig verminderte periphere Insulinsensitivität vorliegt. Insulin-Dysregulation ist eine Equiden-spezifische Stoffwechselerkrankung, die nicht mit dem Diabetes mellitus Typ 2 des Menschen und einer IR vergleichbar ist. Basierend auf unseren Ergebnissen, scheinen Veränderungen des Proteinstoffwechsels eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von ID zu spielen, jedoch sind weitere Studien erforderlich, um diese Hypothesen zu untermauern.

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