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Host-pathogen interaction of Mycoplasma gallisepticum and avian metapneumovirus at the tracheal epithelial surface of chicken

Respiratory pathogens are a health threat to poultry, leading to decreased weight gain and laying performance, increased slaughterhouse condemnation and high treatment costs. One of the most common respiratory pathogens worldwide is Mycoplasma (M.) gallisepticum, the causative agent of chronic respiratory disease in chickens and infectious sinusitis in turkeys. Depending on the virulence, infections with M. gallisepticum result in the development of chronic disease with mild to severe respiratory symptoms. As the smallest self-replicating organism, M. gallisepticum developed a variety of mechanisms to escape the immune response and thus ensure its survival. Adherence, motility, cell invasion, and geno- and phenotypic variations significantly contribute to the chronic course of the disease and lead to ongoing challenges in prophylaxis and treatment management. The adherence-associated proteins, GapA and CrmA, are involved in adherence, gliding, cell invasion and replication, thus contributing to successful host colonisation and immune evasion. We examined whether there is a correlation between the expression of GapA/CrmA and the development of histopathological lesions due to successful host invasion (manuscript 1). The well-established M. gallisepticum R variants Rlow, RCL1, RCL2 and Rhigh were used for tracheal organ culture (TOC) inoculation to determine the relevance of the GapA/CrmA expression.

As examined by quantitative PCR and colony-forming unit assay, the highly virulent GapA/CrmA-positive Rlow and RCL1 were more efficient and rapid in adherence and colonisation to the tracheal epithelium than the low virulent GapA/CrmA-negative RCL2 and Rhigh. This included movement from the cilia to the apical cell membrane, with subsequent partial cell invasion, as detected by immunohistochemical antigen staining. Furthermore, microscopic and histopathological examination revealed a more pronounced ciliostasis and epithelial disintegration after the inoculation with Rlow and RCL1 compared to RCL2 and Rhigh. The only ciliary destruction was observed in the Rlow and RCL1-inoculated TOCs. The level of mucus production was comparable in all TOCs, regardless of differently expressed GapA/CrmA, as detected by Alcian blue staining.

This study confirms that its genetic integrity significantly affects the infection with M. gallisepticum. GapA/CrmA are important for adherence and colonisation and, thus, for the onset and severity of the lesion development in the tracheal epithelium. However, these findings need further investigation as our results suggest that additional proteins are required for the investigated infection steps.

The initial attachment of M. gallisepticum to the target cells may represent a key mechanism, which became evident when avian metapneumovirus (AMPV) was introduced as the co-infecting agent. Infections with AMPV lead to swollen head disease in chickens and rhinotracheitis in turkeys. Exacerbation of clinical symptoms and severe pathological lesions may be the consequence of M. gallisepticum and AMPV co-infection, as both target the same cell type for initial infection. So far, little is known about the host-pathogen-pathogen interaction of M. gallisepticum and AMPV in the respiratory tract of chickens. The second study (manuscript 2) aimed to investigate how co-infection affects pathogenesis and whether the order of infection impacts host responses and lesion development. TOCs were infected with either M. gallisepticum or AMPV, AMPV and M. gallisepticum or in reverse order. The ciliary activity of the different TOC groups was observed microscopically, with histopathological examination for ciliary destruction and epithelial changes. We assessed the pathogen replication and expression of IFN-α, IFN-λ and iNOS by reverse transcriptase (RT) qPCR and examined the colonisation patterns via immunohistochemical pathogen antigen staining.

Initial infection with AMPV, followed by M. gallisepticum, promoted the viral replication and led to more pronounced immune responses and earlier lesion development. Compared to the AMPV and subsequent M. gallisepticum inoculation TOCs, the bacterial load decreased about 24 hours with the reversed infection order, resulting in a delayed replication of M. gallisepticum and lesion development and a weaker immune response. All described parameters were more pronounced in both co-infection groups than in the mono-infection groups.

We demonstrated that co-infections with M. gallisepticum and AMPV induced more severe lesions and host responses than single infections due to synergistic or additive effects of these two pathogens. The order of infection may determine the onset time point and progression of histopathological lesions and clinical symptoms.

Overall, both studies demonstrated that the TOC model was an excellent tool to assess the pathogen-host interactions more closely and independently of external influences. Furthermore, for future studies, the TOC model may be well suited to investigate the role of other M. gallisepticum proteins during individual infection steps and the impact of co-infections on the host and the involved pathogens.

Atemwegsinfektionen führen beim Nutzgeflügel zu verringerten Zunahmen und Legeleistung, sowie erhöhten Verwurfsraten am Schlachthof und hohen Behandlungskosten. Eine der am häufigsten auftretenden respiratorischen Pathogene weltweit ist Mykoplasma (M.) gallisepticum, der Verursacher der „Chronic respiratory disease“ bei Hühnern und der infektiösen Sinusitis bei Puten. Abhängig von der Virulenz führen die Infektionen mit M. gallisepticum in der Regel zu einem chronischen Verlauf mit milder bis schwerer respiratorischer Symptomatik. Dabei hat M. gallisepticum als kleinster selbstreplizierender Organismus eine Vielzahl von Mechanismen entwickelt, um der Immunantwort zu entkommen, und damit das eigene Überleben zu sichern. Adhärenz, Motilität, Zellinvasion, und geno- und phänotypische Variationen tragen maßgeblich zu dem chronischen Verlauf der Erkrankungen bei und führen so zu immer neuen Herausforderungen in der Prophylaxe und im Behandlungsmanagement. GapA und CrmA sind Proteine, welche an der Adhärenz, Motilität, Zellinvasion und Vermehrung von M. gallisepticum beteiligt sind und somit zu der erfolgreichen Wirts-Besiedlung und Immunevasion beitragen. Ob es eine Korrelation zwischen der GapA/CrmA-Expression und der Entwicklung histopathologischer Veränderungen, bedingt durch die Wirtsinvasion gibt, wollten wir in unserer ersten Studie (Manuskript 1) evaluieren. Um die Relevanz der beiden Proteine zu untersuchen, inokulierten wir Trachealringkulturen (TOC) mit den vier etablierten M. gallisepticum R Varianten, Rlow, RCL1, RCL2 und Rhigh.

Wie wir mittels quantitativer PCR und dem Assay für koloniebildende Einheiten ermitteln konnten, zeigten die hoch-virulenten GapA/CrmA-positiven M. gallisepticum-Varianten Rlow und RCL1 eine effizientere Anhaftung und Besiedlung der trachealen Epitheloberfläche, im Vergleich zu den niedrig-virulenten GapA/CrmA-negativen RCL2 und Rhigh. Das schließt die Fortbewegung von den Zilien, zu der apikalen Zellmembran, und Zellinvasion mit ein, wie es durch immunhistologische Antigen-Färbung detektiert wurde. Darüber hinaus beobachteten wir mittels mikroskopischer und histopathologischer Untersuchungen eine ausgeprägtere Ziliostase und Epithel-zerstörung nach Inokulation mit Rlow und RCL1, also mit RCL2 und Rhigh. Eine Zilienzerstörung wurde nur bei den mit Rlow und RCL1 inokulierten TOCs beobachtet. Das Ausmaß der Mukusproduktion war bei allen TOCs vergleichbar ausgeprägt, unabhängig von der unterschiedlichen GapA/CrmA-Expression, wie wir durch Alcianblau-Färbung nachweisen konnten.

Anhand dieser Studie konnten wir eine signifikante Bedeutung von GapA/CrmA während der Adhärenz, bis hin zur Besiedlung, sowie für den Beginn und den Schweregrad der Läsionsentwicklung im Trachealepithel feststellen. Diese Beobachtungen bedürfen jedoch weitere Untersuchungen, da Hinweise darauf hindeuten, dass weitere essentielle Proteine in den untersuchten Infektionsprozessen involviert sind.

Aufgrund der immunmodulierenden Eigenschaften, begünstigen Infektionen mit M. gallisepticum häufig Sekundär-Infektionen, wie beispielsweise mit dem aviären Metapneumovirus (AMPV). Eine Co-Infektion mit AMPV, dem Erreger der „Swollen head disease“ bei Hühnern, bzw. der Rhinotracheitis bei Puten, kann zu einer Verschlimmerung der pathologischen Veränderungen und der klinischen Symptomatik führen.

Co-Infektionen können die Wirt-Erreger-Interaktion eines einzelnen Erregers verändern, wie bereits für verschiedene viral-bakterielle Kombinationen gezeigt werden konnte. Jedoch ist wenig über die Interaktion von M. gallisepticum und AMPV im Respirationstrakt des Huhnes bekannt. Das Ziel der zweiten Studie (Manuskript 2) war es zu untersuchen, inwiefern die Co-Infektion die Pathogenese der Einzel-Erkrankungen verändert und ob es dabei eine Rolle spielt, in welcher Reihenfolge die Erreger den Wirt infizieren. Dafür wurden die TOCs mit M. gallisepticum oder AMPV, AMPV und M. gallisepticum oder in umgekehrter Reihenfolge infiziert, und mittels Lichtmikroskopie, Histopathologie, Immunhistochemie und qPCR vergleichend untersucht. Wir beurteilten die Erregerreplikation und –kolonisation, die Entwicklung pathologischer Läsionen, wie Ziliostase und die Zerstörung der Zilien, und die Expression von IFN-α, IFN-λ und iNOS.

Die Erst-Infektion mit AMPV, gefolgt von M. gallisepticum, steigerte die virale Replikation und führte zu ausgeprägteren Immunreaktionen und einer früheren Entwicklung der Läsionen. Der bakterielle Adhärenzprozess nahm bei umgekehrter Infektions-Reihenfolge ab, was zu einer verzögerten Replikation von M. gallisepticum und einer schwächeren Immunreaktion, sowie einer verzögerten Läsionsentwicklung im Vergleich zu den mit AMPV/M. gallisepticum infizierten TOCs führte. Die untersuchten Parameter zeigten in beiden Co-Infektionsgruppen deutlichere und früher auftretende histopathologische Veränderungen, als in den Einzel-Infektions Gruppen. Anhand verschiedener wirts- und erregerassoziierter Parameter konnten wir nachweisen, dass die Folgen von Co-Infektionen mit M. gallisepticum und AMPV ausgeprägter sind als bei Einzel-Infektionen.

 Wir konnten zeigen, dass Co-Infektionen mit M. gallisepticum und AMPV schwerwiegendere Läsionen und Wirtsreaktionen hervorrufen als Einzel-Infektionen, was auf synergistische oder additive Effekte dieser beiden Erreger zurückzuführen ist. Dabei kann die Reihenfolge der Infektion den Zeitpunkt und die Entwicklung der pathologischen Läsionen und klinischen Symptome bestimmen.

Insgesamt haben beide Studien gezeigt, dass das TOC-Modell ein hervorragendes Instrument ist, um die Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt genauer und unabhängig von äußeren Einflüssen zu untersuchen. Für zukünftige Studien würde sich das TOC-Modell sehr gut eignen, um sowohl die Rolle andere M. gallisepticum Proteine während einzelner Infektionsschritte zu untersuchen, als auch die Auswirkung von Co-Infektionen auf den Wirt und die beteiligten Erreger zu bewerten.

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