Host-pathogen interaction of Mycoplasma gallisepticum and avian metapneumovirus at the tracheal epithelial surface of chicken

Atemwegsinfektionen führen beim Nutzgeflügel zu verringerten Zunahmen und Legeleistung, sowie erhöhten Verwurfsraten am Schlachthof und hohen Behandlungskosten. Eine der am häufigsten auftretenden respiratorischen Pathogene weltweit ist Mykoplasma (M.) gallisepticum, der Verursacher der „Chronic respiratory disease“ bei Hühnern und der infektiösen Sinusitis bei Puten. Abhängig von der Virulenz führen die Infektionen mit M. gallisepticum in der Regel zu einem chronischen Verlauf mit milder bis schwerer respiratorischer Symptomatik. Dabei hat M. gallisepticum als kleinster selbstreplizierender Organismus eine Vielzahl von Mechanismen entwickelt, um der Immunantwort zu entkommen, und damit das eigene Überleben zu sichern. Adhärenz, Motilität, Zellinvasion, und geno- und phänotypische Variationen tragen maßgeblich zu dem chronischen Verlauf der Erkrankungen bei und führen so zu immer neuen Herausforderungen in der Prophylaxe und im Behandlungsmanagement. GapA und CrmA sind Proteine, welche an der Adhärenz, Motilität, Zellinvasion und Vermehrung von M. gallisepticum beteiligt sind und somit zu der erfolgreichen Wirts-Besiedlung und Immunevasion beitragen. Ob es eine Korrelation zwischen der GapA/CrmA-Expression und der Entwicklung histopathologischer Veränderungen, bedingt durch die Wirtsinvasion gibt, wollten wir in unserer ersten Studie (Manuskript 1) evaluieren. Um die Relevanz der beiden Proteine zu untersuchen, inokulierten wir Trachealringkulturen (TOC) mit den vier etablierten M. gallisepticum R Varianten, Rlow, RCL1, RCL2 und Rhigh.

Wie wir mittels quantitativer PCR und dem Assay für koloniebildende Einheiten ermitteln konnten, zeigten die hoch-virulenten GapA/CrmA-positiven M. gallisepticum-Varianten Rlow und RCL1 eine effizientere Anhaftung und Besiedlung der trachealen Epitheloberfläche, im Vergleich zu den niedrig-virulenten GapA/CrmA-negativen RCL2 und Rhigh. Das schließt die Fortbewegung von den Zilien, zu der apikalen Zellmembran, und Zellinvasion mit ein, wie es durch immunhistologische Antigen-Färbung detektiert wurde. Darüber hinaus beobachteten wir mittels mikroskopischer und histopathologischer Untersuchungen eine ausgeprägtere Ziliostase und Epithel-zerstörung nach Inokulation mit Rlow und RCL1, also mit RCL2 und Rhigh. Eine Zilienzerstörung wurde nur bei den mit Rlow und RCL1 inokulierten TOCs beobachtet. Das Ausmaß der Mukusproduktion war bei allen TOCs vergleichbar ausgeprägt, unabhängig von der unterschiedlichen GapA/CrmA-Expression, wie wir durch Alcianblau-Färbung nachweisen konnten.

Anhand dieser Studie konnten wir eine signifikante Bedeutung von GapA/CrmA während der Adhärenz, bis hin zur Besiedlung, sowie für den Beginn und den Schweregrad der Läsionsentwicklung im Trachealepithel feststellen. Diese Beobachtungen bedürfen jedoch weitere Untersuchungen, da Hinweise darauf hindeuten, dass weitere essentielle Proteine in den untersuchten Infektionsprozessen involviert sind.

Aufgrund der immunmodulierenden Eigenschaften, begünstigen Infektionen mit M. gallisepticum häufig Sekundär-Infektionen, wie beispielsweise mit dem aviären Metapneumovirus (AMPV). Eine Co-Infektion mit AMPV, dem Erreger der „Swollen head disease“ bei Hühnern, bzw. der Rhinotracheitis bei Puten, kann zu einer Verschlimmerung der pathologischen Veränderungen und der klinischen Symptomatik führen.

Co-Infektionen können die Wirt-Erreger-Interaktion eines einzelnen Erregers verändern, wie bereits für verschiedene viral-bakterielle Kombinationen gezeigt werden konnte. Jedoch ist wenig über die Interaktion von M. gallisepticum und AMPV im Respirationstrakt des Huhnes bekannt. Das Ziel der zweiten Studie (Manuskript 2) war es zu untersuchen, inwiefern die Co-Infektion die Pathogenese der Einzel-Erkrankungen verändert und ob es dabei eine Rolle spielt, in welcher Reihenfolge die Erreger den Wirt infizieren. Dafür wurden die TOCs mit M. gallisepticum oder AMPV, AMPV und M. gallisepticum oder in umgekehrter Reihenfolge infiziert, und mittels Lichtmikroskopie, Histopathologie, Immunhistochemie und qPCR vergleichend untersucht. Wir beurteilten die Erregerreplikation und –kolonisation, die Entwicklung pathologischer Läsionen, wie Ziliostase und die Zerstörung der Zilien, und die Expression von IFN-α, IFN-λ und iNOS.

Die Erst-Infektion mit AMPV, gefolgt von M. gallisepticum, steigerte die virale Replikation und führte zu ausgeprägteren Immunreaktionen und einer früheren Entwicklung der Läsionen. Der bakterielle Adhärenzprozess nahm bei umgekehrter Infektions-Reihenfolge ab, was zu einer verzögerten Replikation von M. gallisepticum und einer schwächeren Immunreaktion, sowie einer verzögerten Läsionsentwicklung im Vergleich zu den mit AMPV/M. gallisepticum infizierten TOCs führte. Die untersuchten Parameter zeigten in beiden Co-Infektionsgruppen deutlichere und früher auftretende histopathologische Veränderungen, als in den Einzel-Infektions Gruppen. Anhand verschiedener wirts- und erregerassoziierter Parameter konnten wir nachweisen, dass die Folgen von Co-Infektionen mit M. gallisepticum und AMPV ausgeprägter sind als bei Einzel-Infektionen.

 Wir konnten zeigen, dass Co-Infektionen mit M. gallisepticum und AMPV schwerwiegendere Läsionen und Wirtsreaktionen hervorrufen als Einzel-Infektionen, was auf synergistische oder additive Effekte dieser beiden Erreger zurückzuführen ist. Dabei kann die Reihenfolge der Infektion den Zeitpunkt und die Entwicklung der pathologischen Läsionen und klinischen Symptome bestimmen.

Insgesamt haben beide Studien gezeigt, dass das TOC-Modell ein hervorragendes Instrument ist, um die Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt genauer und unabhängig von äußeren Einflüssen zu untersuchen. Für zukünftige Studien würde sich das TOC-Modell sehr gut eignen, um sowohl die Rolle andere M. gallisepticum Proteine während einzelner Infektionsschritte zu untersuchen, als auch die Auswirkung von Co-Infektionen auf den Wirt und die beteiligten Erreger zu bewerten.