Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Evaluation of matrix and induced pluripotent stem cells based approaches for peripheral nerve repair

Peripheral nerve injuries (PNIs) display a worldwide clinical problem. The incidence of PNIs is considered one in a thousand per year, which means that more than 700,000 Europeans are affected each year. Patients with PNIs commonly suffer from chronic pain and permanent disability, which may induce huge socio-economic consequences. Although PNI has a certain ability to regenerate, this is limited to small defect distances. Treatment with tension-free end-to-end suture or autologous nerve graft transplantation for bridging longer distances represent the gold standard repair, but still demonstrate certain disadvantages. So looking for a substitute is very necessary. This thesis focused on two different substitution strategies, in study I we evaluated a material science based approach of adding a regenerative hydrogel as luminal filler into clinically approved hollow nerve guidance conduits. Since the presence of regeneration promoting Schwann cells in the nerve bridge is crucial for successful nerve repair, the second study included into this thesis evaluated the possibility of, and modified a protocol for, differentiating sufficient numbers of viable and expandable Schwann cell progenitors and Schwann cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). In study I, we evaluated the function of modified hyaluronic acid-laminin-hydrogel (M-HAL) as a luminal filler for clinically approved hollow nerve guides in a rat critical defect size model. We proved once again that autologous nerve graft (ANG) repair is a reliable gold standard, and showed that the performance of empty nerve guide grafts might be somewhat improvable by adding M-HAL. Two concentrations of M-HAL were filled into chitosan-based nerve guides. Our evaluation revealed that both provided better support for axonal and functional recovery than the previously tested 0.2% hyaluronic acid-laminin-hydrogel (HAL). Based on our extensive in vitro studies, we infer that this impact is more likely attributable to structural support of axonal extension than to M-HAL creating a conducive environment for preserving the repair phenotype of invading Schwann cells. In study II, I have established an improved protocol, modified from previously published ones, for successfully differentiating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into Schwann cell precursor cells (hiPSC-SCPs) in high purity and cell numbers. These cells can now be maintained and expanded for a certain number passages in which they show stable morphological characteristics and a specific gene profile. Further, from amplifiable hiPSC-SCPs differentiation hiPSC-derived Schwann cells (hiPSC-SCs) can be produced in high purity in one week. The differentiated hiPSC-SCs have a similar morphology and genetic phenotype when compared to primary adult human Schwann cells (ahSCs). The hiPSC-SCs could represent a promising source for cell therapy approaches in the future clinical transplantation for peripheral nerve repair. However, future studies are needed to reveal if hiPSC-SCs can indeed be a useful tool for improving functional outcome in critical defect size models for nerve repair. For these studies, results of both studies included into this thesis delivered important information on how to modify hollow chitosan based nerve conduits into tissue-engineered constructs.

Periphere Nervenverletzungen (PNI) stellen ein weltweites klinisches Problem dar. Die jährliche Häufigkeit von PNI beträgt eins zu tausend, was bedeutet, dass jedes Jahr mehr als 700.000 Europäer betroffen sind. Patienten mit PNI leiden häufig unter chronischen Schmerzen und dauerhaften Behinderungen, was enorme sozioökonomische Folgen nach sich ziehen kann. Obwohl PNI eine gewisse Regenerationsfähigkeit besitzen, trifft dies nur auf Verletzungen mit einer kurzen Distanz zwischen den Nervenenden zu. Die Behandlung mit einer spannungsfreien End-zu-End-Naht oder einer autologen Nerventransplantation zur Überbrückung größerer Entfernungen stellt den Goldstandard der Regeneration dar, ist aber mit gewissen Nachteilen verbunden. Die Suche nach einer alternativen Methode ist daher dringend notwendig. Die vorliegende Arbeit beschreibt zwei verschiedene Substitutionsstrategien. In Studie I haben wir einen materialwissenschaftlichen Ansatz untersucht, wobei regeneratives Hydrogel als luminaler Füllstoff in zugelassene hohle Nervenleitschienen eingebracht wurde. Da die Gegenwart von regenerationsfördernden Schwann-Zellen innerhalb der Nervenbrücke für eine erfolgreiche Nervenreparatur entscheidend ist, wurde in Studie II in dieser Arbeit die Möglichkeit untersucht, eine ausreichende Anzahl lebensfähiger und expandierbarer Schwann-Zellvorläuferzellen und Schwann-Zellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu gewinnen und es wurde ein entsprechendes Protokoll zur Differenzierung dieser Zellen modifiziert. Da die Gegenwart von regenerationsfördernden Schwann-Zellen innerhalb der Nervenbrücke für eine erfolgreiche Nervenreparatur entscheidend ist, wurde dieses Modell in Studie II dieser These näher betrachtet. Dafür wurde ein Differenzierungsprotokoll für eine ausreichende Anzahl lebensfähiger und expandierbarer Schwann-Zellenvorläufer und Schwann-Zellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) auf Basis eines zuvor veröffentlichten Protokolls etabliert. In Studie I haben wir die Funktion von modifiziertem Hyaluronsäure-Laminin-Hydrogel (M-HAL) als luminales Füllmaterial für klinisch zugelassene hohle Nervenleitschienen in einem Rattenmodell mit kritischer Defektgröße untersucht. Wir konnten erneut zeigen, dass die Reparatur mit autologen Nerventransplantaten (ANG) ein zuverlässiger Goldstandard ist und dass die Regenerationsfähigkeit in leeren Nervenleitschienen durch die Zugabe von zwei verschiedenen Konzentrationen M-HAL verbessert werden kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass beide Konzentrationen eine verbesserte axonale und funktionelle Wiederherstellung erzielten, als das zuvor getestete 0.2% Hyaluronsäure-Laminin-Hydrogel (HAL). Auf der Grundlage unserer umfangreichen in vitro Studien schließen wir, dass diese Wirkung primär auf die strukturelle Unterstützung des axonalen Wachstums zurückzuführen ist, und nicht darauf, dass M-HAL ein geeigneteres Umfeld für den Erhalt des Reparaturphänotyps der einwandernden Schwann-Zellen schafft. In Studie II habe ich ein, im Vergleich zu früheren Veröffentlichungen, verbessertes Protokoll zur erfolgreichen Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) in Schwann-Zellenvorläuferzellen (hiPSC-SCPs) mit hoher Reinheit und Zellzahl entwickelt. Diese Vorläuferzellen können nun mit konstanten morphologischen Merkmalen und einem spezifischen Genprofil für eine bestimmte Anzahl von Passagen kultiviert und expandiert werden. Darüber hinaus können innerhalb von einer Woche aus amplifizierbaren hiPSC-SCPs differenzierte hiPSC-derived Schwann-Zellen (hiPSC-SCs) in hoher Reinheit generiert werden. Die differenzierten hiPSC-SCs weisen eine ähnliche Morphologie und ein ähnliches Genprofil wie primäre adulte humane Schwann-Zellen (ahSCs) auf. Die hiPSC-SCs können ein vielversprechender Ausgangspunkt für zelltherapeutische Ansätze bei zukünftigen klinischen Transplantationen zur Reparatur peripherer Nerven darstellen. Anschließende Studien müssen jedoch beweisen, ob die hiPSC-SCs tatsächlich eine geeignete Methode zur Verbesserung der funktionellen Ergebnisse in Modellen für die Nervenreparatur mit kritischer Defektgröße sind. Die Ergebnisse beider Studien aus dieser Arbeit liefern bereits wichtige Informationen, inwieweit hohle Nervenleitschienen auf Chitosan-Basis im Sinne des Tissue engineering gestaltet werden könnten.

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