Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Verwendung von respiratorischen Air-Liquid Interface Epithelzellkulturen als Screening-Methode zur Bestimmung der Empfänglichkeit verschiedener Spezies für eine SARS-CoV-2 Infektion

Ausgehend von Wuhan, China verursachte die Coronavirus-Krankheit-2019 (COVID-19) bedingt durch das Schwere-Akute-Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2 (SARS-CoV-2) ein weltweites pandemisches Geschehen mit erheblichen wirtschaftlichen und gesellschaftlichen Folgen. Wie auch bei anderen bekannten Betacoronaviren wurden Fledermäuse bereits kurz nach der Entdeckung von SARS-CoV-2 als wahrscheinliches Virusreservoir diskutiert. Ein potentieller Zwischenwirt, welcher das Virus auf den Menschen übertrug, wurde hingegen
bislang nicht identifiziert. Zusätzlich werden bei immer mehr domestizierten, in
Gefangenschaft sowie wildlebenden Tierarten natürliche SARS-CoV-2 Infektionen
nachgewiesen oder vermutet. Daher ist eine Untersuchung möglichst vieler Tierarten, welche eine potentielle Quelle für die weitere Verbreitung des Virus sowie Entstehung von neuen Variants of Concern (VOCs) darstellen könnten, auf deren Empfänglichkeit für SARS-CoV-2 essentiell. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Haus- sowie Wildtiere auf ihre Suszeptibilität für SARS-CoV-2 anhand von trachealen Epithelzellen, welche unter Air-Liquid Interface (ALI) Bedingungen kultiviert wurden, untersucht. Dies diente unter anderem auch der Etablierung dieser in vitro Kulturmethode als geeignete Methode zur Ergänzung von in vivo Experimenten mit Tiermodellen. Dazu wurde tracheales Gewebe von frisch
verstorbenen Tieren, darunter Katzen, Hunde, Frettchen, Schweine und jeweils eine Kuh, Giraffe, ein Mufflon, Elch, Nyala und Alpaka entnommen und anhand dieser Gewebeproben ALI-Kulturen hergestellt. Die in vitro Kulturen wurden anschließend mit einem SARS-CoV-2 Isolat (Pango lineage B.1.513) inkubiert und die Replikation anhand einer Virustitration gemessen. Die darauffolgende lichtmikroskopische Auswertung umfasste eine morphologische Evaluierung von Hematoxylin-Eosin (H&E)- sowie immunhistochemischgefärbten Kulturen zur Detektion von zytopathogenen Effekten. Zusätzlich wurde eine Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antigen sowie des zellulären Rezeptors Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (ACE2) durchgeführt. Eine effiziente SARS-CoV-2 Replikation wurde bei felinen ALI Kulturen nachgewiesen, während Hunde,
Frettchen, Schweine und die untersuchten Ungulaten mit Ausnahme einer bovinen ALI Kultur resistent gegen eine Infektion mit dem Virus waren. Hinsichtlich ihrer Morphologie zeigten Kulturen mit nachgewiesener Virusreplikation keine statistisch signifikanten Unterschiede im Vergleich mit nicht-infizierten Kontrollen. SARS-CoV-2 Antigen wurde mittels Immunfluoreszenz in felinen ALI Kulturen nachgewiesen, wohingegen ACE2 in keiner der Proben detektiert wurde. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt sich schließen, dass die Generierung von primären trachealen Epithelzellkulturen verschiedener Tierspezies und anschließende Infektion mit SARS-CoV-2 ein geeigneter Ansatz zur Entdeckung bisher unerkannter Virusreservoire sein könnte. Jedoch weist diese Vorgehensweise einige Limitationen auf. Zytopathogene Effekte, welche in vorhergegangenen Studien bei humanen ALI Kulturen nachgewiesen wurden, konnten bei den im Rahmen dieser Arbeit generierten Kulturen von verschiedenen Spezies trotz nachgewiesener Infektion nicht festgestellt werden. Bei Frettchen und Hunden, welche in vivo empfänglich für SARS-CoV-2 sind, ließ sich in vitro anhand von trachealen ALI Kulturen keine Virusreplikation und korrelierend dazu auch
kein positives Signal für SARS-CoV-2 Antigen in der Immunfluoreszenz-Analyse
nachweisen. Möglicherweise deutet dieses Ergebnis auf einen Zelltropismus von SARS-CoV-2 für andere Bereiche des Respirationstraktes, beispielsweise die Nase oder Lunge, bei diesen Tierarten hin, aber auch der Einfluss adverser Kulturbedingungen könnte ursächlich dafür gewesen sein. Eine Einschränkung bezogen auf die Generierung und Kultivierung der ALI Kulturen stellen die anatomischen Gegebenheiten der Tierarten dar. Hierzu gehört vor allem
die geringe Länge und der kleine Umfang der Trachea bei Labortieren wie Mäusen, Hamstern und Ratten. Tracheale ALI Kulturen von Hamstern, welche in vivo aufgrund ihrer hohen Empfänglichkeit für SARS-CoV-2 als Tiermodell für das humane COVID-19 Krankheitsbild von großer Bedeutung sind, konnten in der vorliegenden Studie nicht adäquat generiert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass aus primären respiratorischen Epithelzellen gewonnene ALI Kulturen eine vielversprechende Ergänzungsmethode zur Erforschung von viralen und anderen Pathogenen bei Menschen sowie diversen Tierspezies darstellen. Der
Einsatz dieses und anderer in vitro Kulturmodelle sollten jedoch aufgrund deren Limitationen nicht als vollständiges Äquivalent für in vivo Versuche verstanden werden. Möglicherweise können aber durch zukünftige neuartige und verbesserte Kulturmethoden wie beispielsweise Co-Kultursysteme oder der komplementäre Einsatz verschiedener ex vivo und in vitro Modelle weitere Fortschritte auf dem Gebiet der Ersatz- und Ergänzungsmittel im Sinne des 3R-Prinzips erzielt werden.

Originating from Wuhan, China the coronavirus disease 2019 (COVID-19) with its causative agent severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) triggered a global pandemic with immense economic and sociological consequences. Shortly after the discovery of SARS-CoV-2, bats were found to be a likely virus reservoir. However, an intermediate host ultimately responsible for the original transmission of SARS-CoV-2 to the human population has not yet been identified. Additionally, natural infections with SARS-CoV-2 have been reported or suspected in a multitude of domestic animals as well as wildlife species. Therefore, there is an urgent need for identification of possible unknown animal reservoirs, which could further spread the virus and lead to the development of new variants of concern (VOCs). In the present work, various animal species were investigated for their susceptibility to SARS-CoV-2 infection. This was performed by generating tracheal epithelial cell cultures under air-liquid interface (ALI) conditions to ensure full cellular differentiation. The aim of using these in vitro cell cultures was to establish an applicable model system, which could reduce the need for in vivo animal experimentation. In order to achieve this, tracheal tissue from recently deceased animals, including cats, dogs, ferrets, pigs and one cow, giraffe, mouflon, moose, nyala and alpaca respectively was dissected and processed for the generation of ALI cultures. Then, a SARS-CoV-2 isolate (Pango lineage B.1.513) was used for infection of these cells and its replication was measured by virus titration. The subsequent light microscopic evaluation included hematoxylin and eosin (H&E) as well as immunohistochemical staining in order to detect cytopathogenic effects. Furthermore, immunofluorescence staining for SARS-CoV-2 antigen as well as its cellular receptor angiotensin-converting enzyme (ACE2) was performed. Efficient viral replication was observed in feline cell cultures, whereas dogs, ferrets, pigs and the various examined ungulates – except for one bovine ALI culture – were resistant to infection with SARS-CoV-2. Regarding cellular morphology, cultures supporting viral replication did not show any statistically significant differences compared to their uninfected controls. SARS-CoV-2 antigen was detected in feline ALI cultures using immunofluorescence microscopy, whereas there was no detection of ACE2 in any of the examined samples. The results of this study indicate that the generation of primary tracheal epithelial cell cultures derived from various animal species and following infection with SARS-CoV-2 could represent an appropriate method to detect previously unknown reservoirs. However, this approach has several limitations. Previous studies using human-derived ALI cultures have shown that cytopathogenic effects can be observed following SARS-CoV-2 infection. In the present study, ALI cultures derived from animal species did not display convincingly documented cytopathogenic effects despite detected viral infection. SARS-CoV-2 replication was not seen in ferrets and dogs, which have been demonstrated to be susceptible to infection in vivo, and correspondingly, viral antigen was not detected in these cell cultures by immunofluorescence microscopy. Possibly, this suggests a cellular tropism of SARS-CoV-2 for other areas of the respiratory tract, e.g. the nose or lung, in these animal species, but other factors such as the influence of adverse culture conditions could also be responsible for the lack of detectable virus infection. Another limitation, regarding the generation and cultivation of ALI cultures, is related to the anatomical variation in different animal species, especially concerning the reduced length and diameter of the trachea of laboratory rodents such as mice, hamsters and rats.  In the present study, it was not possible to generate tracheal ALI cultures from small laboratory species such as hamsters, which represent an important animal model for the human COVID-19 due to their high susceptibility to SARS-CoV-2, most likely as a consequence of their size. In conclusion, primary respiratory epithelial cells cultured under ALI conditions constitute a promising complementary method for the investigation of viral and other pathogens in humans as well as animal species. However, because of their limitations, this and other in vitro cell culture models should not be taken as a replacement for in vivo animal testing. Possibly in the future, novel culture methods such as co-culture systems or the complementary use of ex vivo and in vitro models generated from different organ tissues can advance the field of alternative and supplementary methods in the interest of the 3R principle (Replace, Reduce, Refine).   

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