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Establishment of a viral vector-mediated animal model for Parkinson's disease and evaluation of the transduction potential of FGF-2 isoforms in vitro

Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder of the central nervous system affecting the elderly with an increasing prevalence in today’s society. Marked by three typical motor symptoms, tremor, rigidity, and bradykinesia, certain histopathological features determine the diagnosis of PD: the overexpression of a-synuclein (a-syn) in neurons, especially of the dopaminergic (DA) system, which mainly contributes to the formation of Lewy bodies (LBs) and leads to a degeneration of DA neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc). Because of the degeneration of DA neurons localized in the SNpc, their projections to the striatum (STR) and the respective fibre density of those projections diminish. The loss of fibres results in a decrease of released dopamine, an important neurotransmitter in the feedback loops of the basal ganglia (BG), which initiate movement. The reduction or loss of this neurotransmitter, as seen in PD, conditions the development of typical motor impairments. However, PD is also determined by a variety of non-motoric symptoms (e.g., constipation, depression, sleep disorders, reduced olfaction) that are equally contributing to the complex disease pathology. To best mimic the pathophysiology of the disease and especially the motor phenotype, the aim of this study was to establish a rat animal model driven by the overexpression of a-syn which was introduced by the adeno-associated viral vector serotype rAAV/DJ. This particular model enables the development of a progressive decrease of DA neurons in the SNpc, which results in an accompanying loss of striatal fibre density. Quantitative histomorphological evaluation was performed as well as behavioral tests (staircase, stepping, and cylinder test), to determine the degree of neurodegeneration and the severity of the induced motor phenotype. A moderate loss of DA neurons in the SNpc and an equal loss of fibre density in the STR was found, which was reflected in the stepping and the cylinder test in a decrease of performance compared to baseline measurements performed before viral injection and consecutive a-syn overexpression. Surprisingly, an unexpected improvement in motor performance in the staircase test was observed. This increase could be the result of an ongoing adaptation and hence training effects to the test together with only little neurodegeneration at the early points in time, for which the staircase test proved not to be sensitive enough. Although a plethora of therapeutic strategies to treat PD symptoms have been developed over the past decades, ranging from pharmacotherapy, surgical interventions, as realized by deep brain stimulation (DBS), and gene manipulation, none of those is able to stop the ongoing neurodegeneration and therefore provide an ultimate cure. Cell replacement therapy provides a promising alternative since it is based on replacing degenerated DA cells with mesenchymal or induced pluripotent stem cells (MSCs or iPSCs, respectively), which can increase the levels of the lacking dopamine in the STR of the recipient, reducing motor impairments and decelerating disease progression. To enhance the survival of the cell transplants in the STR, neurotrophic factors (NTFs) are applied to stimulate the survival and fibre ingrowth of the grafted cells. Within this thesis, the neuroprotective potential of the distinct isoforms of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) was explored in vitro as an alternative therapeutic approach to increase the viability of transplanted cell grafts comprised of DA neurons. Therefore, in the second part of the study, the efficiency of the FGF-2 isoforms, high molecular weight (FGF-2HMW) and low molecular weight (FGF-2LMW), to transduce DA progenitor cells were evaluated in vitro. Transduction efficiencies of both isoforms were compared to each other to select the isoform suitable for future cell transplantation. Both FGF-2 isoforms revealed an equally high potential to transduce DA cells, which qualifies both as promising candidates for future cell transplantations. In conclusion, this study established a viral vector-mediated animal model for PD, based on a-syn pathology which provides insights into the pathomechanisms and especially the development of motor impairments of PD. Furthermore, this animal model proved to be suitable to evaluate therapeutic approaches, especially cell replacement therapy, due to its progression over time, which enables it to mimic the early stage of PD with a moderate occurrence of pathology and symptoms. Both FGF-2 isoforms, FGF-2HMW and FGF-2LMW,were found to be suitable regarding their ability to transduce DA cells and therefore promote cell survival and proliferation of cell grafts designated for future transplantation.  

 

 

Morbus Parkinson ist eine neurodegenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems und betrifft vorwiegend die ältere Bevölkerung mit einer stetig steigenden Prävalenz in der heutigen Gesellschaft. Die Krankheit wird von drei prominenten Symptomen geprägt, Tremor, körperliche Steifheit, auch Rigidität genannt, und Bradykinese, eine Langsamkeit der Bewegungen. Die Diagnose basiert jedoch auch auf den histopathologischen Merkmalen. Diese sind eine vermehrte Expression des Proteins alpha-Synuclein (a-syn), welches als hauptsächlicher Bestandteil der typischen Einschlusskörperchen „Lewy Körperchen“ auftritt. Hauptsächlich sind dabei dopaminerge (DA) Neurone betroffen, die sich überwiegend in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) befinden und als Folge der Toxizität von a-syn degenerieren. Daraus resultiert der Verlust der dopaminergen Nervenfasern, welche ins Striatum projizieren. Dies lässt sich anhand einer morphometrischen Analyse mittels Faserdichtebestimmung feststellen. Mit dem Verlust der Fasern wird auch weniger Dopamin ausgeschüttet, ein wichtiger Neurotransmitter, der im Regelkreis der Basalganglien für die Initiation von Bewegung notwendig ist. Fällt dieses Signal weg oder ist deutlich reduziert, wie es bei Morbus Parkinson der Fall ist, beginnen sich die typischen motorischen Symptome zu zeigen. Daneben können aber auch eine Reihe nicht motorischer Symptome beobachtet werden (z.B. Konstipation, Depression, Schlafstörungen und reduzierte Geruchswahrnehmung), welche zu der Komplexität der Pathologie beitragen. Die Etablierung von Tiermodellen, die das Krankheitsgeschehen von Parkinson nachahmen, hilft, die Pathomechanismen und die degenerativen Prozesse besser zu verstehen und die Entstehung der motorischen Symptome nachzuvollziehen. Da es bisher nicht gelungen ist, mit einem Tiermodell alle pathologischen Merkmale der Krankheit zufriedenstellend darzustellen, war das Ziel dieser Studie, mit Hilfe des viralen Vektors AAV/DJ die Überexpression von a-syn zu initiieren und somit eine Degeneration von dopaminergen Neuronen und der striatalen Fasern herbeizuführen. Durch histomorphologische Analysen und einer Auswahl an Verhaltenstests (Staircasetest, Steppingtest und Zylindertest) konnte das Ausmaß der Neurodegeneration erfasst und die Schwere des motorischen Phänotyps evaluiert werden. Als Folge der viralen Injektion wurde ein moderater Verlust von dopaminergen Zellen und Fasern erzielt, der zu der Ausprägung von motorischen Symptomen führte, die in zwei der drei Verhaltenstest (Steppingtest und Zylindertest) deutlich nachzuvollziehen waren. Dass es im Staircasetest überraschend zu einer Verbesserung in der auszuführenden Aufgabe kam, lässt sich zum einen durch einen anhaltenden Trainingseffekt, und zum anderen durch eine gewisse Unempfindlichkeit des Tests gegenüber nur geringen Einbußen im nigrostriatalen System erklären. Eine Vielfalt an unterschiedlichen Therapieoptionen steht Patienten heutzutage zur Verfügung, welche die Symptome der Erkrankung lindern und somit die Lebensqualität verbessern können. Die Optionen reichen von medikamentöser Therapie über chirurgische Eingriffe, wie zum Beispiel Tiefenhirnstimulation, bis hin zu Gentherapie. Allerdings gibt es bis heute keine Therapieform, die das Absterben der Neuronen verlangsamt oder aufhält und somit die Heilung von Parkinson herbeiführen kann. Die vielversprechendste Therapieoption, die zurzeit entwickelt wird, ist die Zellersatztherapie. Hierbei werden dem Patienten Transplantate aus mesenchymalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen in das Striatum eingesetzt, welche dann die abgestorbenen Fasern ersetzten und selbst Dopamin produzieren. Diese Dopaminsubstitution kann die motorischen Einschränkungen wieder aufheben und soll langfristig zu einer Verlangsamung des Krankheitsprozesses führen. Damit die Zelltransplantate auch über Jahre hinweg ihre Wirksamkeit nicht verlieren, wird in der Forschung daran gearbeitet, die Zellen mit der Zugabe von neurotrophen Faktoren zu modifizieren, und somit das Überleben und das weitere Faserwachstum der Zellen zu verbessern. Ein besonders vielversprechender neuroprotektiver Faktor ist dabei der Fibroblasten Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) und seine beiden Isoformen, die sich in ihrem Wirkmechanismus unterscheiden. Im zweiten Teil der Studie wurden dopaminerge Progenitorzellen von Rattenembryonen mit Hilfe des gleichen viralen Vektor Serotyps transduziert, der die beiden Isoformen von FGF-2, hochmolekular und niedermolekular (FGF-2HMW und FGF-2LMW), in den Zellen überexprimiert. Die Transduktionsrate beider Isoformen wurde miteinander verglichen, um Klarheit darüber zu erhalten, ob eine der beiden Formen für zukünftige Zelltransplantationstherapien besser geeignet ist. Beide Isoformen des neurotrophen Faktors konnten eine hohe Zahl von dopaminergen Neuronen transduzieren, was sowohl FGF-2HMW und FGF-2LMW zu geeigneten Kandidaten macht, in zukünftigen Zelltransplantationen eingesetzt zu werden. Zusammengefasst konnte durch diese Studie ein Tiermodell des Morbus Parkinson etabliert werden, welches ein frühes Stadium der Erkrankung darstellt und zu einem besseren Verständnis über die der Krankheit zugrunde liegenden Pathomechanismen und den daraus resultierenden motorischen Phänotypen führt. Außerdem erwies sich das Tiermodell auf Grund seiner Nachahmung eines frühen Krankheitsstadiums mit einer moderaten Ausprägung an Pathologie und Symptomen als geeignet, für die Erprobung von therapeutischen Ansätzen, wie der Zelltransplantationstherapie, eingesetzt zu werden. Um die Aussichten auf eine erfolgreiche Zelltransplantation in das Striatum zu verbessern, die nicht nur zu einer Verbesserung der Symptomatik, sondern auch zu einer Verlangsamung des neurodegenerativen Prozesses führt, wurden in dieser Studie die Eigenschaften der beiden FGF-2 Isoformen FGF-2HMW und FGF-2LMW im Hinblick auf das Transduzieren von dopaminergen Zellen in Zellkultur untersucht und für den zukünftigen therapeutischen Einsatz als geeignet befunden.

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