Establishment of stably transfected claudin expressing canine prostate cancer cell lines with red fluorescent protein for gold nanoparticle-mediated laser perforation intervention
Cancer cell inoculation in laboratory animals is routinely used to generate in vivo
models for the evaluation of novel therapeutic approaches in prostate cancer.
However, detailed characterization of cancer spreading, early tumor development, and therapeutic response is often limited, as conventional cell lines do not allow advanced deep tissue imaging. Therefore, in this study, two canine prostate tumor fluorescent cell lines were established. 0840-FusionRed and 0846-FusionRed stably express a fluorescent protein in the red spectrum. The generated fluorescent cell lines are detectable in living animals, and therefore provide a valuable option for the deep tissue in vivo imaging. In comparison to their parental cell lines, transcriptome analysis generally shows no significant changes. Claudin proteins are deregulated in many cancer types including prostate cancer. Accordingly, claudins are used as markers to detect and target cancer. Moreover, they are promising subjects for the evaluation of novel therapeutic approaches. The Cterminal of Clostridium perfringens enterotoxin (C-CPE) efficiently binds to several
claudins. Thus, in this thesis, recombinant C-CPE conjugated gold nanoparticles
(AuNPs) were used for specific ablation of claudin expressing canine prostate
adenocarcinoma (PAC) and transitional cell carcinoma (TCC) cell lines using gold nanoparticle-mediated laser perforation (GNOME-LP). Claudin-3, -4, and -7 gene and protein expression in the fluorescent cell lines were confirmed by quantitative real-time PCR and immunofluorescence. Localization experiments showed the binding of the recombinant C-CPE194-319 to claudin-3, -4, and -7 expressed by cancer cells. Furthermore, the opto-perforation of cancer cells treated with C-CPE functionalized AuNPs by the GNOME-LP technique killed over 70 % of the claudin-positive cancer cells at a laser fluence of 72 mJ/cm² and a scanning speed of 5 mm/s. Therefore, GNOME-LP with C-CPE functionalized AuNPs represents a promising efficient approach for ablation of claudin-positive cancer cells. Finally, the established cell lines and the verified proof of concept in vitro provide the
basis for perspective xenograft in vivo studies. The introduced red fluorescence
enables deep tissue imaging in living animals and therefore detailed characterization of tumor growth and subsequently, possible tumor ablation through C-CPE-AuNPs treatment. Since dogs represent an excellent model for human prostate cancer, the development of therapeutic strategies provides an important contribution to translational research directed at treating humans, thus providing benefits for both species.
Über die Inokulation unterschiedliche Faktoren, gekoppelt an Zelllinien in Labortieren, werden routinemäßig in-vivo-Modelle generiert, um neue therapeutische Ansätze auch für Prostatakrebs zu testen. Die detaillierte Charakterisierung des Tumorwachstums, der Metastasierung und die Kontrolle der therapeutischen Wirkung ist allerdings begrenzt, da die Bildgebung des tieferen Gewebes eingeschränkt ist. Daher wurden in der vorliegenden Studie zwei stabil fluoreszierende Hunde-Prostatatumor-Zelllinien etabliert, um damit das Wachstum im Labortier nach Inokulation sichtbar zu machen. Die transfizierte Kanine Prostatakarzinom-Zelllinie 0846-FusionRed und die Übergangskarzinom-Zelllinie 0840-FusionRed exprimieren stabil ein Protein, welches im roten Spektrum emittiert. Die so generierten fluoreszierenden Zelllinien sind nach Übertragung im lebende Tiere nachweisbar und bieten damit die Voraussetzung für die in vivo Bildgebung im tiefen Gewebe. Im Vergleich zu ihren parentalen Linien zeigt
die Transkriptomanalyse der transfizierten Zelllinien keine wesentlichen
Veränderungen. Claudin-Proteine sind bei vielen Tumorentitäten, einschließlich Prostatakrebs, dereguliert. Daher sind sie in der Krebsdiagnostik und -therapie als Marker geeignet, um solche Tumoren zielgerichtet zu detektieren und zu behandeln. Das C-terminale Fragment des Clostridium perfringens Enterotoxin (C-CPE) bindet spezifisch an Claudinen. In der eigenen Untersuchung wurden rekombinante C-CPE-konjugierte Goldnanopartikel (AuNPs) verwendet. Diese waren das Instrument, um eine spezifische Ablation von Claudin-exprimierenden Prostata-Adenokarzinom-(PAC) und Übergangszellkarzinom-(TCC) Zelllinien mit der Gold-Nanopartikel-vermittelten Laserperforation (GNOME-LP) Technik zu erarbeiten. Die Claudin-3, -4 und -7 Gen- und Proteinexpression in den fluoreszierenden Zelllinien (0840-und 0846 FusionRed) wurden mittels quantitativer real-time PCR und Immunfluoreszenz nachgewiesen. Lokalisierungsexperimente zeigten die Bindung des rekombinanten C-CPE194-319 an Claudin-3, -4 und -7 auf Krebszellen. Es gelang, mit der Optoperforation von mit CCPE funktionalisierten AuNPs behandelte Krebszellen mittels der GNOME-LP Technik diese abzutöten. Die Effektivität lag bei 70 % der Claudin-positiven Krebszellen bei
einer Laserfluenz von 72 mJ/cm2 und einer Scangeschwindigkeit von 5 mm/s. Damit ist die GNOME-LP mit C-CPE funktionalisierten AuNPs eine vielversprechende und effiziente Methode zur Ablation von Claudin-positiven Krebszellen. Die so transfizierten Zelllinien bilden gemeinsam mit dem verifizierten Proof of Concept in vitro die Grundlage für perspektivische Xenograft-in vivo-Studien. Die etablierte sichtbare rote Fluoreszenz in Tumor Zelllinien ist die Voraussetzung, um in der Tiefe des Gewebes lebende Tiere eine bessere Charakterisierung des injizierten Tumorwachstums darzustellen. Darauf aufbauend kann eine Tumorablation auf Basis einer C-CPE-AuNPs-Therapie visualisiert werden. Hunde sind ein hervorragendes Modell für Prostatakrebs und können so die Entwicklung therapeutischer Strategien in der translationalen Forschung auch zur Behandlung des Menschen voranbringen.
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