Molekularbiologische Aufklärung des ursächlichen Gendefekts der Hämophilie bei der Hunderasse Hovawart
In zwei nicht verwandten Hundepopulationen wurde für die Rasse Hovawart erstmals Hämophilie A und B beschrieben. Für verwandte Hovawarts lagen über mehrere Generationen Befunde vor, die auf eine hereditäre Hämostasestörung hinwiesen. Ausgehend von zwei verstorbenen hämophilen Rüden (#79: F VIII:C 11 % [60–150 %]; #3: F IX 2 % [75–140 %]) wurden in einer Stammbaumanalyse obligate Trägertiere zurückverfolgt. Asymptomatische Hündinnen dienen oft als Konduktorinnen, die das Defektallel unerkannt weitervererben. Um die Ursache des X-chromosomal rezessiv vererbten F VIII- und F IX-Mangels genauer zu analysieren, wurden molekulargenetische Untersuchungen durchgeführt, da bisher Gentests fehlten. Die isolierte DNA von Hunden der Hovawartfamilien konnte in Polymerase-Ketten-Reaktionen für die kodierenden und untranslatierten Bereiche des caninen F VIII-Gens (CanFam3.1, NC_006621.3, Cfa Xq28; 151 370 bp) sowie des gesamten F IX-Gens (Cfa Xq26,3 bis 27,1; 32 458 bp) eingesetzt werden. Im Sequenzvergleich mit Referenztieren ließen sich neun Varianten im F VIII-Gen detektieren, der ursächliche Gendefekt für Hämophilie A konnte in den untersuchten kodierenden Bereichen, benachbarten Exon-Intron-Übergängen und untranslatierten Regionen ausgeschloßen werden. In der Sequenzanalyse wurde eine Einzelbasenpaardeletion in der 5‘-UTR gefunden, die sich im caninen F IX-Promoter (X:109 501 492delC) im Bereich der Bindungsmotive der Transkriptionsfaktoren Androgen-Rezeptor und HNF4α befand. Eine Genotypisierung mittels RFLP-Analyse mit RsaI zeigte eine familienspezifische Mutation, die nun per Gentest bestimmt werden kann. Mittels Electrophoretic Mobility Shift Assay und Dual-Luciferase Reporter-Gen-Assay konnte die Deletion als Ätiologie für Hämophilie B bei der untersuchten Hovawartfamilie bewiesen werden. Hämophilie B beim Hovawart ähnelt dem Krankheitsbild humaner Hämophilie B Leyden, das eine androgenabhängige Verbesserung der Symptomatik mit Einsetzen der Pubertät bei Jungen zeigt.
Hemophilia A and B were first described for the Hovawart dog in two unrelated dog populations. For related Hovawarts, results indicating a hereditary hemostasis disorder were available over several generations. Based on two deceased hemophilic males (#79: F VIII:C 11% [60-150%]; #3: F IX 2% [75-140%]), obligate carriers were retraced in a pedigree analysis. Asymptomatic females often serve as carriers, passing on the defect allele unrecognized. In order to analyze the cause of the X-linked recessive inherited F VIII and F IX deficiency in Hovawart dogs in more detail, molecular genetic studies were performed, as genetic tests were missing so far. Isolated DNA from dogs of the Hovawart families could be used in polymerase chain reactions for the coding and untranslated regions of the canine F VIII gene (CanFam3.1, NC_006621.3, Cfa Xq28; 151,370 bp) and the entire F IX gene (Cfa Xq26.3 to 27.1; 32,458 bp). Sequence comparison with reference animals revealed nine variants in the F VIII gene, and the causative gene defect for hemophilia A could be excluded in the coding regions, adjacent exon-intron junctions, and untranslated regions examined. Sequence analysis revealed a single base pair deletion in the 5'-UTR located in the canine F IX promoter (X:109501492delC) in the region of the binding motifs of the transcription factors androgen receptor and HNF4α. Genotyping by RFLP analysis with RsaI revealed a family-specific mutation that can now be determined by genetic testing. Using electrophoretic mobility shift assay and dual-luciferase reporter gene assay, the deletion was proven to be the etiology for hemophilia B in the Hovawart family studied. Hemophilia B in Hovawarts resembles human hemophilia B Leyden, which shows an androgen-dependent improvement of symptoms with the onset of puberty in boys.
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