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Inhibition of Host Kinase Activity : Effects on Influenza A Virus Infection and Host Cell Signaling

Influenza viruses (IVs) are major human respiratory pathogens which present a significant public health threat and are responsible for multiple pandemics (1918, 1957, 1968, and 2009). IVs infect 5–10% of the human population annually, resulting in 3 to 5 million cases of severe illness and about 290000 to 650000 deaths [1,2]. Evasion from host immunity, acquired through prior infections or vaccination, allows these viruses to continue causing epidemic outbreaks. Direct-acting agents (DAAs) and mechanical ventilation are currently used to treat severe influenza cases [3]. Unfortunately, variants resistant to DAAs are on the rise in contemporary seasonal influenza strains, highlighting their vulnerability to virus adaptability [4-10]. Host targeted antivirals do not suffer from this limitation because resistance would require the pathogen to exploit a different host factor or to become less reliant on the targeted host factor, both requiring significant mutational changes [11].

Influenza A- (IAV) and influenza B-viruses (IBV) do not encode a viral kinase. Nonetheless, several phosphorylation sites in IAV proteins have been identified [12]. The phosphorylation of these residues is essential for scaffolding, activity, and/or the protein-protein interaction profile of the phosphorylated protein [13-15]. Processes such as viral entry, uncoating, vRNA and protein synthesis, viral protein and virion translocation, and release of viral particles depend on phosphorylation, which requires the recruitment of cellular kinases [16-24]. Additionally, kinase activity is a central signaling component of cellular signaling pathways relevant for the immunophathogenicity of IV infections. Several studies have demonstrated the importance of direct and indirect kinase-mediated regulation of viral replication and evasion/suppression/exploitation of cellular response signaling cascades [16-20,23,25-38].

Abnormal kinase activity is associated with several pathologies, including cancer, diabetes, or neurodegenerative diseases. The search for treatment options led to the development and investigation of several small-molecule kinase inhibitors (SMKIs). According to data from clinical trials, approximately 110 novel kinases are being investigated as potential targets for inhibition. Taken together with the approximately 45 targets of approved kinase inhibitors, the target spectrum represents about 30% of the human kinome [39]. 71 SMKIs have been FDA-approved, but none of the inhibitors is currently used to treat IAV infections or other virus infections [16,39,40]. The repurposing of FDA-approved SMKIs presents an alluring option as they have been thoroughly vetted for safety and are available for treatment of patients and testing in clinical trials.

In this thesis, we have evaluated the effect of forty-six FDA-approved SMKIs on IAV replication in vitro. We have identified twelve compounds targeting twenty-two kinases to reduce viral replication by more than ~10-fold in a dose-dependent MOI-independent manner. These compounds were validated in a biologically relevant ex vivo human precision-cut lung slice (hPCLS) model to show efficacy against contemporary seasonal and pandemic IAVs. We identified the steps of the virus infection cycle affected by these inhibitors and assessed the effect of these inhibitors on the host response. The observed effects on viral titers are equally strong or surpass the effect of clinically used DAAs in vitro and ex vivo. Additionally, our results confirm the suggested substantial genetic barrier to the emergence of resistant variants to all SMKIs we evaluated. We subsequently defined host signaling components mediating direct effects on viral replication, such as EGFR, FAK, and Src, and kinases involved in host response signaling of replication relevant signaling pathways (RRSP), such as Raf/MEK/ERK, PI3K/Akt/mTOR, NF-κB, or JAK/STAT, as targets for future therapeutics. Among this group, the most significant potential for antiviral therapy options lies in the modulation of the Raf/MEK/ERK cascade. This signaling pathway is a reoccurring motif in all effective inhibitors we tested in the two presented studies.

Taken together, we provide data that contributes to a deeper understanding of kinase-mediated effects involved in the pathogenesis and replication of IAVs. Specific SMKIs directed against these kinases allow to precisely target and anticipate virus-induced alteration of host-cell signaling and may be the key to the next generation of influenza therapy.

Influenzaviren (IVs) sind wichtige Krankheitserreger der menschlichen Atemwege, die eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen und für mehrere Pandemien (1918, 1957, 1968 und 2009) verantwortlich sind. IVs infizieren jährlich 5–10 % der menschlichen Bevölkerung, was zu 3 bis 5 Millionen schweren Krankheitsfallen und etwa 290.000 bis 650.000 Todesfallen fuhrt [1,2]. Die Umgehung der Wirtsimmunität, die durch frühere Infektionen oder Impfungen erworben wurde, ermöglicht es diesen Viren, weiterhin epidemische Ausbruche zu verursachen. Direkt auf das Pathogen wirkenden Medikamenten (DAAs) und mechanische Beatmung werden derzeit zur Behandlung schwerer Influenza-Fälle eingesetzt [3]. Das vermehrte auftreten DAA-resistenter Varianten bei aktuellen saisonalen Influenza-Stämmen unterstreicht die Anfälligkeit dieser Wirkstoffe für die Anpassungsfähigkeit von Viren [4-10]. Wirtsgerichtete antivirale Medikamente sind nicht von dieser Einschränkung betroffen, da eine Resistenz erfordern würde, dass der Erreger einen anderen Wirtsfaktor nutzt oder weniger abhängig von dem entsprechenden Wirtsfaktor wird, was beides signifikante mutanionale Veränderungen erfordert [11]. Influenza A- (IAV) und Influenza B-Viren (IBV) kodieren keine virale Kinase. Dennoch wurden mehrere Phosphorylierungsstellen in IAV-Proteinen identifiziert [12]. Die Phosphorylierung dieser Aminosäurereste ist wesentlich für Struktur, Aktivität und/oder das Protein-Protein-Interaktionsprofil des phosphorylierten Proteins [13-15]. Prozesse wie viraler Eintritt, Enthüllen, vRNA- und Proteinsynthese, virale Protein- und Viriontranslokation und Freisetzung viraler Partikel hängen von der Phosphorylierung ab, die die Rekrutierung zellularer Kinasen erfordert [16-24]. Darüber hinaus ist die Kinaseaktivität eine zentrale Signalkomponente zellulärer Signalwege, die für die Immunphathogenität von IV-Infektionen relevant sind. Mehrere Studien haben die Bedeutung der direkten und indirekten Kinase-vermittelten Regulierung der viralen Replikation sowie der Umgehung, Unterdrückung, Ausnutzung zellulärer Antwortsignalkaskaden gezeigt [16-20,23,25-38].

Eine abweichende Kinaseaktivität wird typischerweise mit mehreren Pathologien in Verbindung gebracht, darunter Krebs, Diabetes oder neurodegenerative Erkrankungen, was zur Entwicklung und Untersuchung mehrerer niedermolekularer Kinase-Inhibitoren (SMKIs) für den klinischen Einsatz geführt hat. Daten aus klinischen Studien zufolge werden zurzeit etwa 110 neue Kinasen als potenzielle Angriffspunkte für eine wirtsgerichtete Therapie untersucht. Zusammen mit den etwa 45 Zielen zugelassener Kinase-Inhibitoren repräsentiert das Inhibitionsspektrum etwa 30 % des menschlichen Kinoms [39]. Bisher wurden 71 SMKIs von der FDA zugelassen, aber keiner der Inhibitoren wird derzeit zur Behandlung von IAV-Infektionen oder anderen Virusinfektionen eingesetzt [16,39,40]. Die Umnutzung von FDA-zugelassenen SMKIs birgt großes Potential, da die Substanzen bereits gründlich auf Sicherheit geprüft wurden und für die Behandlung von Patienten und Tests in klinischen Studien zur Verfügung stehen.

In dieser Arbeit haben wir die Wirkung von 46 von der FDA zugelassenen SMKIs auf die IAV-Replikation in vitro untersucht. Wir haben zwölf Verbindungen identifiziert, welche die Aktivität von zweiundzwanzig Kinasen inhibieren, und die virale Replikation dosisabhängig und MOI-unabhängig um mehr als das 10-fache zu reduzieren. Diese Verbindungen wurden von uns in einem biologisch relevanten Ex-vivo-Präzisionsschnitt-Lungenschnittmodell (hPCLS) validiert, um die Wirksamkeit gegen aktuelle saisonale und pandemische IAV zu demonstrieren. Wir identifizierten die Schritte des Virusinfektionszyklus, die von diesen Inhibitoren beeinflusst werden, und bewerteten die Wirkung dieser Inhibitoren auf die Wirtsantwort. Die beobachteten Wirkungen auf Virustiter sind gleich stark oder übertreffen die Wirkung von klinisch verwendeten DAAs in vitro und ex vivo. Darüber hinaus bestätigen unsere Ergebnisse die zuvor aufgestellte Hypothese einer erheblichen genetische Barriere für die Entstehung resistenter Varianten aller von uns bewerteten SMKIs. Durch den Vergleich sich überlagernder Inhibitionsprofile der getesteten SMKIs konnten wir Wirtskinasen identifizieren, die direkte Wirkungen auf die virale Replikation vermitteln, wie EGFR, FAK und Src, und Kinasen, die an replikationsrelevanten Signalwegen (RRSP) beteiligt sind, wie Raf/MEK/ERK, PI3K/Akt/ mTOR, NF-κB oder JAK/STAT. In dieser Gruppe liegt das bedeutendste Potenzial für antivirale Therapieoptionen in der Modulation der Raf/MEK/ERK-Kaskade, da dieser Signalweg ein wiederkehrendes Motiv aller wirksamen Inhibitoren ist, die von uns in den beiden vorgestellten Studien getestet wurden.

Zusammengenommen liefert die vorliegenden Arbeit die Datengrundlage für ein tieferes Verständnis der Kinase-vermittelten Pathogenese und Replikation von IAVs. Spezifische SMKIs, die gegen diese Kinasen gerichtet sind, ermöglichen es, die virusinduzierte Veränderung der Wirtszellsignalisierung spezifisch zu antizipieren, und könnten der Schlüssel zur nächsten Generation der Influenzatherapie sein.

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