Vergleichende Untersuchungen zu Keimgehalten von thermophilen Campylobacter spp. in der Broilerfleisch-Gewinnung mittels quantitativer real-time PCR und kultureller Methode unter besonderer Berücksichtigung der Belastung von Fleisch in Verbraucherverpackung
Campylobacter spp. sind die häufigsten bakteriellen Erreger lebensmittelbedingter Magen-Darm-Erkrankungen des Menschen und werden häufig beim Geflügel nachgewiesen. Ein ernstzunehmendes Problem in der Mastgeflügelproduktion stellt die Kontamination der Schlachtkörper mit Campylobacter spp. während der Mast und Schlachtung dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die quantitative Campylobacter-Belastung auf der jeweiligen Stufe der Gewinnung, im Bestand, am Schlachthof sowie unter MAP verpackte Geflügelfleischprodukte, untersucht und bewertet. Die Bestimmung der Probenahmepunkte erfolgte unter dem Aspekt, Änderungen der Keimzahl auf verschiedenen Ebenen der Produktion feststellen und eine Aussage über die Verbreitung der Keime in der Broilerfleisch-Gewinnung treffen zu können. Dabei war es Ziel der durchgeführten Untersuchungen, Zusammenhänge zwischen den Ergebnissen der Probenentnahmen im Mastbetrieb und am Schlachthof zu ermitteln, unter Berücksichtigung der angewandten diagnostischen Methodik. Die 26 untersuchten Partien aus zwei Betrieben (A, n = 12; B, n = 14) wurden seitens der am Projekt beteiligten Unternehmen durch Vorab-Untersuchungen von Sockentupfern als Campylobacter-positiv identifiziert. Zu jeder untersuchten Herde wurden vor der Entnahme der Tiere zur Schlachtung sechs Poolproben von Blinddarmkot im Bestand und am Schlachthof sechs Einzelproben von Blinddarmkot gewonnen. Die Untersuchungen am Schlachthof umfassen sechs Einzelproben von Nackenhaut nach der Kühlung der Schlachtkörper. Nach der Zerlegung wurden jeweils neun Proben verpackter Schenkel mit Haut und neun Proben Brustfilets ohne Haut entnommen und handelsüblich unter Schutzatmosphäre (MAP) verpackt. Sechs dieser Proben je Kategorie wurden direkt untersucht. Die restlichen drei Proben wurden zum Ende des angegebenen Verbrauchdatums untersucht. Alle Proben wurden parallel zu dem kulturell-mikrobiologischen Verfahren auch mittels qPCR auf den Gehalt an Campylobacter spp. untersucht. Die quantitativ kulturellen Untersuchungen auf Campylobacter in den gepoolten Fäzes-Proben (n = 26) aus dem Bestand vor der Ausstallung sowie der Blinddarmproben aus der Schlachtung erbrachte für beide Probentypen in 97,4 % ein positives quantitatives Ergebnis. Die partieweise Betrachtung der Mittelwerte zeigte für die Fäzes-Poolproben einen Mittelwert von 4,6 log10 KbE/ml. Die Campylobacter-Zahl in den Blinddarmproben lag im Mittel bei 5,8 log10 KbE/ml. In der Mehrzahl der Untersuchungen lag die mittlere Campylobacter-Zahl in den Blinddarm-Proben über den Werten der Fäzes-Poolproben aus dem Bestand. Die Differenz zwischen den beiden Probentypen lag im Mittel bei 1,16 log10 KbE/ml. Die Ergebnisse der Untersuchungen der weiteren Proben zeigten, dass Schenkel mit Haut oder die Halshaut sowohl einen höheren Anteil Campylobacter-positiver Proben aufwies als auch höhere Keimzahl-Werte, im Vergleich zu den Brustfleischproben. Beim Vergleich der Untersuchung der Fleischproben direkt nach der Schlachtung und zum Ende des Verbrauchdatums zeigte sich in der Tendenz ein niedrigerer Gehalt kultivierbarer Campylobacter zum Ende des Verbrauchdatums. Die Lagerung 8 Tage bei +4 ° C unter MAP hatte eine Reduzierung der Campylobacter-Zahl in den Brustfilet- und Schenkelproben zur Folge. Dadurch konnte eine Reduktion von Campylobacter spp. um ca. 1 log10 KbE/ml erreicht werden. Im Folgenden sind die Ergebnisse der qPCR der verschiedenen Probenmatrizes dargestellt. Die höchsten Nachweisraten von 100 % wurden im Blinddarminhalt und in den Fäzes-Poolproben aus den Stallungen nachgewiesen. Der Campylobacter-Keimgehalt (Mittelwert) in Fäzes-Proben war generell niedriger (6,8 log10 KbE/ml) als in den Blinddarmproben (7,4 log10 KbE/ml). Die Ergebnisse der Untersuchungen der weiteren Proben zeigten, dass die Brustfiletproben (86,5%, 3,73 log10 KbE/ml) niedriger belastet waren als die Schenkelproben (97,4%, 4,37 log10 KbE/ml) und die Halshautproben (93,5%, 3,86 log10 KbE/ml). Zum Ende des Verbrauchsdatums sanken die Campylobacter-Keimgehalte in den verpackten Schenkel und Brustfiletproben ab (Brustfilet: 77,2%, 3,69 log10 KbE/ml und Schenkel: 87,8%, 4,18 log10 KbE/ml). Bei dem Vergleich auf Betriebsebene ergaben sich deutliche Unterschiede bei der Campylobacter-Zahl in Brustfiletproben. Die Tobit-Regressionsmodelle zeigten jedoch, dass Fäzes-Proben im Allgemeinen keine direkte Vorhersage der Campylobacter spp.-Belastung in Blinddarm- oder Halshautproben erlauben. Die Blinddarmproben sind hingegen geeignet, die Campylobacter spp.-Zahl auf Halshaut- und Brustfiletproben vorherzusagen. Somit kann davon ausgegangen werden, dass eine Senkung der Konzentrationen von Campylobacter spp. im Blinddarm von Masthähnchen zu einer geringeren Kontamination des Fleisches nach der Verarbeitung führen kann. Eine vergleichende Betrachtung beider Methoden zum Campylobacter-Nachweis zeigte, dass mit der quantitativen real-time PCR-Methode in der Regel um 2 log10-Stufen höhere Campylobacter-Keimzahlen im Vergleich zur kulturellen Methode ermittelt wurden. Das bedeutet, dass aus den schnellen zu bestimmenden Ergebnissen der qPCR nicht direkt die kulturell quantitative Belastung des Broiler-Fleisches abgelesen werden kann. Aber die qPCR Methode kann angewendet werden um besonders stark belastete Partien zu identifizieren. Für eine mögliche Verbesserung der Ergebnisübereinstimmung aus der mikrobiologischen Keimzählung und der qPCR wurde als eine weiterführende Untersuchung eine Differenzierung lebender und toter Campylobacter-Zellen in der qPCR durchgeführt. Hierfür wurde die DNA-interkalierende Substanz EMA eingesetzt, die an die DNA von toten, membrangeschädigten Zellen bindet und dadurch die anschließende qPCR Amplifikation verhindert. Die EMA-qPCR wurde an Kotproben (Fäzes und Blinddarm) getestet. Ergebnisse dieser Methode wurden ebenfalls mit Ergebnissen der klassisch mikrobiologischen Keimzählung verglichen. Mittels der EMA-qPCR konnten keine Ergebnisse erzielt werden, die mit der kulturellen Untersuchung vergleichbar waren. Die Verwendung der EMA-qPCR schien allerdings einen kleinen Vorteil gegenüber der qPCR ohne Verwendung von EMA zu erbringen. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse liefern unterstützende Daten für eine Expositionsabschätzung des Verbrauchers mit Campylobacter aus der Geflügelfleischgewinnung und über die Vergleichbarkeit von Campylobacter spp.-Nachweisen mittels kultureller Untersuchung, qPCR oder EMA-qPCR auf unterschiedlichen Stufen der Produktion.
Campylobacter is the most common bacterial cause of foodborne gastrointestinal infections in humans and is frequently detected in poultry. The contamination of broiler meat by Campylobacter during fattening and slaughter is a serious problem in poultry production. In this project, the quantitative Campylobacter load was investigated and evaluated at each production stage, in the flock, in the abattoir and also in cuts of meat packaged under a modified atmosphere. The sampling points were chosen in order to detect changes in the bacterial load at the different production stages and also to determine any possible spread of the bacteria in the broiler production chain. The aim of the investigations was to determine possible correlations between the results of samples taken at the fattening farm and at the abattoir, with the diagnostic methodology used also taken into consideration. The 26 examined flocks from two individual farms (A, n = 12; B, n = 14) were identified as Campylobacter spp. positive using sock swabs before slaughter. For each flock, six pooled samples of feces were taken on the farm before removal of the birds for slaughter and six individual cecal samples were taken at the abattoir. The investigation at the abattoir comprised six individual samples of neck skin taken after chilling the carcass. After preparation, nine samples of skinless breast fillets and nine samples of thighs with skin were taken and packed under standard conditions under a modified atmosphere. Six samples of each type were tested immediately. The remaining three samples of each type were tested at the end of the consumption date. All samples were tested in parallel by culture methods and qPCR for the presence of thermophilic Campylobacter. The quantitative results of cultures from 26 flocks, from pooled fecal samples from the farm before the removal of birds and cecal content at the abattoir yielded positive results in 97.4 of cases for both sample types. Examination of the mean values showed a mean value of 4.6 log10 CFU/mL for the fecal pool samples. The Campylobacter count in the cecal samples averaged 5.8 log10 CFU/mL. In the majority of cases the mean Campylobacter count in the cecal samples was higher than the values in the fecal pool samples. The difference between the two sample types averaged 1.1610 log CFU/mL. The results of the examinations of the other samples showed that thighs with skin or the neck skin had higher proportions of Campylobacter-positive samples and higher bacterial counts compared to the breast meat samples. When comparing the tests of the samples taken directly after slaughter with those taken at the end of the end of the consumption date, there is a trend towards a lower level of culturable Campylobacter at the end of the consumption date. Storage for 8 days at +4 ° C under MAP resulted in a reduction of Campylobacter counts in the breast fillet and thigh samples. This resulted in a reduction of Campylobacter approximately 1 log10 CFU/mL. The qPCR results of the different sample matrices from 26 positive flocks are shown below in comparison to the culture results. Campylobacter was detected in 100% of the cecal and in fecal pool samples. The mean concentration of Campylobacter counts in fecal samples was generally lower (6.8 log10 CFU/mL) than in the cecal samples (7.4 log10 CFU/mL). The results of the analyses of the other samples showed that the breast fillet samples (86.5%, 3.73 log10 CFU/mL) were less contaminated than the thigh samples (97.4%, 4.37 log10 CFU/mL) and the neck skin samples (93.5%, 3.86 log10 CFU/mL). By the end of the end of the consumption date, Campylobacter levels had decreased in the packaged thigh and breast fillet samples (breast fillet: 77.2%, 3.69 log10 CFU/mL and thighs: 87.8%, 4.18 log10 CFU/mL). The comparison at the farm level revealed significant differences in Campylobacter counts in breast fillet samples. Tobit regression models, however, showed that fecal samples generally do not accurately predict Campylobacter spp. load in cecal or neck skin samples. The cecal samples are useful for predicting Campylobacter spp. counts on neck skin and breast fillet samples. Thus, it can be assumed that a reduction in the concentrations of Campylobacter spp. in the cecum of broiler may result in less contamination of the meat after processing. A comparative analysis of the two methods for Campylobacter detection showed that Campylobacter counts measured by qPCR were generally 2 log10 CFU/mL levels higher than those obtained by microbiological cultures. This means that the results of qPCR cannot be used to determine contamination as defined by quantitative microbial cultures. The qPCR can however be used for the rapid identification of particularly highly contaminated flocks. In an attempt to improve the agreement between the results from culture and qPCR, additional experiments were performed with the aim of differentiating between viable and nonviable Campylobacter cells by qPCR. For this purpose, the DNA-intercalating dye EMA was used, which penetrates damaged membranes of nonviable cells, irreversibly binds to the nonviable cell’s DNA and blocks the DNA amplification during the PCR. The EMA method was tested in fecal and cecal samples. The results using this EMA-qPCR method were compared to the results from the quantitative culture method. No results comparable to the cultural assay could be obtained using EMA-qPCR. However, the use of EMA-qPCR appears to provide a slight advantage for detecting viable Campylobacter spp. over qPCR without the use of EMA. The results presented in this study provide important data for an estimation of consumer exposure to Campylobacter from the food sector and on the comparability of Campylobacter spp. detections by cultural examination, qPCR or EMA-qPCR at different stages of production.
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