Botulinum-Neurotoxin-Typen C, D und ihre Mosaikformen C/D und D/C (BT x C, D, C/D, D/C), die hauptsächlich von Clostridium botulinum Typ C und D produziert werden, verursachen bei Tieren Botulismus und gehören zu den giftigsten Substanzen für Geflügel und Fisch. Im Gegensatz zur Toxinproduktion anderer Botulinum-Neurotoxin-Arten (BT x) ist die Biosynthese dieser Toxintypen phagenkodiert. Bisher basieren die wichtigsten Nachweismethoden bei klinischem Botulismus auf dem Mausbioassay. Hierfür ist jedes Jahr eine Vielzahl an Tierversuchen mit einer großen Anzahl an Testtieren von Nöten. In den letzten Jahren sind Alternativen zum Ersatz dieses Mausbioassays für den Nachweis und die Charakterisierung von Botulinumtoxinen zunehmend interessanter geworden.

In unseren Untersuchungen versuchten wir C. botulinum-Isolate des Typs C genauer zu analysieren und zu beschreiben. Dabei verwendeten wir verschiedene Arten von Analysemethoden, wie die Pulsfeldgelelektrophorese und die Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie. Hierbei konnten wir ein Massen­spektrometrieverfahren für kommerziell erhältliches Neurotoxin Typ C in Kulturmedien und ein Verfahren zum Nachweis von Neurotoxin direkt im Kulturüberstand etablieren. Dabei verwendeten wir Probenbedingungen mit und ohne peptische Vorbehandlung und eine 2D-Nano-LC-MS/MS-Technik. Entscheidender Unterschied zu anderen Studien ist hier die Verwendung von Kulturüberständen aus verschiedenen Isolaten von C. botulinum Typ C im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten, mit handelsüblichem Toxin gespikten Proben in anderen Veröffentlichungen. Somit ist die beschriebene Technik zusätzlich zu bekannten Verfahren eine Methode zur Detektion des Toxins in komplexen Proben, welche mit klinischen Proben von kranken, verendeten oder verdächtigen Tieren oder Umweltproben vergleichbar sind. Zusätzlich zum Nachweis von BT x C konnten wir auch Proteinfragmente aus C3- und C2-Toxin nachweisen, die ebenfalls Phagen- bzw. plasmidkodierte Toxine von C. botulinum darstellen. Damit konnten wir auch ohne direkten Toxinnachweis das Vorhandensein des toxinkodierenden Phagen und somit die Möglichkeit Neurotoxin zu produzieren bestätigen. Es konnten auch einige spezifische Proteine, welche durch das Kerngenom des Bakteriums von C. botulinum codiert werden, identifiziert werden und damit auch die Trägerbakterien des Phagen weiter spezifiziert werden. Dies ermöglicht einen neuen Ansatz zur Untersuchung von beispielsweise Umweltproben, Futtermitteln im Falle von Toxoinfektionen oder auch zur Ursachenforschung bei Ausbrüchen. Dies ist insbesondere für die Veterinärmedizin interessant, vor allem für Erkrankungen wie dem „viszeralen Botulismus“ oder der Equinen Grass Sickness.

Des Weiteren wurde eine verfeinerte Methode der Pulsfeldgelelektrophorese entwickelt, um möglichst viele Isolate zu analysieren. Hier waren unter anderem die Verwendung von Formaldehyd und die Verwendung des Enzyms Apa I die wichtigsten Neuerungen zur Verbesserung bereits vorhandener Protokolle.

Insgesamt mussten wir aber auch feststellen, dass es weiterhin auch bei diesen Methoden diverse Schwierigkeiten und Grenzen bei der Analyse von Proben gibt. So bleibt zum Beispiel die Anzucht der Clostridien ein großes Problem. Weitere Schwierigkeiten stellen unter anderem der Verlust des Phagen während der Kultivierung, die Versporung der Bakterien, eine fehlende Toxinbildung aus unterschiedlichsten Gründen und die mangelhafte Sensitivität der Methode der Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie bei komplexeren Proben dar.