Long-term outcome in a rat model of birth asphyxia with neonatal seizures and the impact of pharmacological intervention with midazolam

Welzel, Björn

Dissertation 2022 CC BY 4.0

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Long-term outcome in a rat model of birth asphyxia with neonatal seizures and the impact of pharmacological intervention with midazolam

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Eine perinatale Asphyxie ist eine der Hauptursachen für eine erhöhte Sterblichkeit und eine Schädigung des Gehirns von Neugeborenen. Die resultierende hypoxisch-ischämische Enze-phalopathie (HIE) führt häufig zu akuten Anfällen und Spätfolgen wie Epilepsie sowie motorischen, kognitiven und Verhaltensstörungen. Die derzeitige symptomatische Behandlung neonataler Anfälle mit Phenobarbital führt nur bei etwa 50% der Patienten zur Anfallsfreiheit und hat keinen positiven Einfluss auf die Langzeitfolgen. In den aktuell eingesetzten präklinischen Nagermodellen wird entweder eine Hypoxie allein oder eine Hypoxie in Kombination mit einer chirurgisch induzierten Ischämie zur Auslösung neonataler Anfälle verwendet, so dass eine systemische Hyperkapnie als ein grundlegender Bestandteil der Asphyxie fehlt. Neue präklinische Studien in optimierten Nager-Asphyxie-Modellen mit höherer translationaler Validität sind dringend erforderlich, um wirksame Therapien für die HIE und für die damit verbundenen Folgen zu entwickeln. In den vorliegenden Studien haben wir ein neues, nicht-invasives Rattenmodell für Asphyxie und neonatale Anfälle verwendet, um die verhaltensbe-zogenen und neurologischen Langzeitfolgen in diesem Modell zu ermitteln und die pharmakologische Intervention mit dem Benzodiazepin Midazolam zu untersuchen.

In diesem Modell wurde bei männlichen und weiblichen Ratten am Tag 11 nach der Geburt eine intermittierende Asphyxie ausgelöst, indem die Tiere für 30 Minuten Gasmischungen aus 9% oder 5% Sauerstoff (drei 7- und 3-minütige Zyklen) und 20% Kohlenstoffdioxid ausgesetzt wurden. Zusätzlich wurden die Ratten mit Vehikel oder mit 1 mg/kg Midazolam intraperitoneal direkt nach der Asphyxie behandelt. Acht verschiedene Verhaltenstests wurden im Laufe von 14 Monaten systematisch durchgeführt, um die Ratten nach der Asphyxie mit Kontrollen zu vergleichen. Zehn Monate nach der Asphyxie wurden epidurale Schraubenelektro-den implantiert, um eine kontinuierliche Video-/Elektroenzephalographie-Überwachung über sieben Tage (24/7) zur möglichen Diagnose einer Epilepsie durchzuführen. Darüber hinaus wurden 14 Monate nach der Asphyxie die Neuronendichte in Hirnregionen, die bei menschlichen Patienten nach der HIE häufig betroffen sind, sowie aberrante axonale Verbindungen im Hippocampus immunhistologisch untersucht. Aufgrund von Neuroinflammation und Erkrankungen der weißen Substanz in der akuten Phase nach einer HIE wurden außerdem Hirnschnitte von Tieren mit oder ohne Behandlung 72 Stunden nach der Asphyxie untersucht.

Die Vehikel-Tiere zeigten unmittelbar nach dem Ende der Asphyxie konvulsive und nicht-konvulsive neonatale Anfälle, während 55% (12/22) der mit Midazolam behandelten Tiere anfallsfrei waren. Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit Midazolam nach der Asphyxie das Auftreten konvulsiver neonataler Anfälle signifikant von 95% (21/22) auf 18% (4/22). Die Vehikel-Tiere zeigten drei und sechs Monate nach der Asphyxie eine Beeinträchtigung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses im radial-arm water maze sowie ein erhöhtes Angstverhalten im light-dark box test sechs und 14 Monate nach der Asphyxie. Neurodegeneration im Hippocampus und im Thalamus sowie aberrante Verbindungen der Moosfasern in der CA3a-Region des Hippocampus konnten festgestellt werden. Die Behandlung mit Midazolam verhinderte oder verringerte die meisten dieser Folgen unabhängig von der anfallsunterdrückenden Wirkung an Tag 11 und zeigte in den ersten Tagen nach der Asphyxie eine deutliche entzündungshemmende Wirkung. Im Gegensatz dazu hatte Midazolam keinen Einfluss auf die Entwicklung spontan wiederkehrender Anfälle, da sowohl die Vehikel- als auch die Tiere der Midazolam-Gruppe Anfälle zeigten.

Zusammenfassend rekapituliert das vorliegende Modell viele Aspekte einer perinatalen Asphyxie und mehrere der mit einer HIE beim Menschen verbundenen Langzeitfolgen, und besitzt somit eine gute translationale Validität. Midazolam scheint eine vielversprechende Substanz zur Unterdrückung neonataler Anfälle und zur Vorbeugung von Langzeitfolgen der HIE zu sein. Interessanterweise traten in Tieren mit neonatalen Anfällen trotz Midazolam-Behandlung keine ausgeprägteren Langzeitfolgen auf, was darauf hindeutet, dass der positive Effekt von Midazolam auf andere Mechanismen zurückzuführen ist, wie etwa die entzündungshemmende Wirkung. Zur Potenzierung der antikonvulsiven Wirkung könnte die Kom-bination von Midazolam mit anderen rational ausgewählten Substanzen, die unterschiedliche pharmakologische Zielstrukturen modulieren, untersucht werden. Die reproduzierbaren Ergebnisse in den Verhaltenstests sowie die deutlichen pathohistologischen Veränderungen bieten mögliche Endpunkte für weitere pharmakologische Studien. Die Ergebnisse dieser Studien tragen zu einem besseren Verständnis der Langzeitfolgen einer Asphyxie bei und ebnen den Weg für die Entwicklung neuer Therapien zur Prävention neonataler Anfälle und der Spätfolgen in diesen stark betroffenen Säuglingen.

Birth asphyxia is a major cause of neonatal death and brain damage. The asphyxia-induced hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is often associated with seizures and the later-life outcomes include epilepsy and motor, cognitive, and behavioral impairments. The current state-of-the-art symptomatic treatment of neonatal seizures with phenobarbital leads to seizure freedom in only about 50% of patients and exerts no beneficial effect on the long-term consequences. In established preclinical rodent models for neonatal seizures, either hypoxia alone or hypoxia in combination with surgically induced ischemia is used for the induction of neonatal seizures. Therefore, these models lack systemic hypercapnia as a fundamental constituent of birth asphyxia. Novel preclinical studies in optimized rodent asphyxia models with higher face validity are urgently needed for the development of effective therapies to prevent HIE and the associated consequences. Here we used a novel noninvasive rat model of birth asphyxia to identify long-term behavioral and neurological outcomes in this model and to evaluate the early pharmacological intervention with the benzodiazepine midazolam.

In this model, intermittent asphyxia was induced in male and female postnatal-day 11 rats by a 30-minute exposure to gas mixtures containing 9% or 5% oxygen (three 7- and 3-minute cycles) at constant 20% carbon dioxide. In addition, rats were treated either with vehicle or with 1 mg/kg midazolam intraperitoneally directly after asphyxia. Eight different behavioral tests were performed systematically over 14 months for comparison of the post-asphyxial rats to sham controls. At ten months after asphyxia, epidural screw electrodes were implanted, and 24/7 video/electroencephalography monitoring was performed over one week to determine the development of epilepsy. Furthermore, at 14 months post asphyxia, the neuronal density in brain regions commonly affected in human patients after HIE and mossy fiber sprouting in the hippocampus were evaluated by immunohistological analysis. In addition, due to the occurrence of neuroinflammation and white matter disease in the acute phase after HIE, brain slices of animals with or without treatment were examined at 72 hours after asphyxia.

All vehicle-treated animals developed convulsive or nonconvulsive neonatal seizures immediately after the end of asphyxia, whereas 55% (12/22) of midazolam-treated animals were seizure-free. In addition, treatment with midazolam after asphyxia significantly reduced the occurrence of convulsive neonatal seizures from 95% (21/22) to 18% (4/22). The vehicle-treated animals showed impaired spatial learning and memory in the radial-arm water maze at three and six months post asphyxia, and increased anxiety-related behavior in the light-dark box test at six and 14 months post asphyxia. Neurodegeneration was observed in the hippocampus and the thalamus, as well as aberrant mossy fiber sprouting in the CA3a region of the hippocampus. Treatment with midazolam prevented or reduced most of these consequences independently from its anti-seizure effect and revealed a marked anti-inflammatory potency in the early days after asphyxia. In contrast, midazolam did not affect the occurrence of sponta-neous recurrent seizures, as in both midazolam- and vehicle-treated animals seizures were detected at 10.5 months after asphyxia.

In conclusion, the present model recapitulates the physiological aspects of birth asphyxia and several of the long-term consequences associated with human HIE, which underlines its high face validity. The benzodiazepine midazolam seems to be a promising drug for the suppression of acute neonatal seizures and the prevention of long-term consequences of HIE. Interestingly, no difference between animals with and without neonatal seizures regarding the later-life outcome was observed, indicating that the positive outcome is rather due to a different mechanism, such as midazolam’s anti-inflammatory effect. For potentiation of the observed anti-seizure effect, the combination of midazolam with other rationally chosen drugs for multi-target drug therapy could be further evaluated. The reproducible results in the behavioral tests as well as the clear pathohistological changes offer possible endpoints for further pharmacological studies. The results of the present studies contribute to a better understanding of the long-term consequences of birth asphyxia and pave the way for the development of new therapies to prevent neonatal seizures and the later-life consequences in these highly affected infants.