Untersuchungen zur Tenazität von Enterococcus cecorum
Virulente Isolate von Enterococcus cecorum (EC) sind seit Anfang der Jahrtausendwende weltweit beim Masthuhn bekannt und verursachen die sogenannte Enterokokken-Spondylitis. Neben der erhöhten Mortalität verursachen die entstehenden Therapiekosten, eine erhöhte Verwurfsrate am Schlachthof sowie wiederkehrende EC-Infektionen in konsekutiven Mastdurchgängen wirtschaftlichen Schaden. Trotz der stetig wachsenden, weltweiten Bedeutung von EC fehlen aufgrund einer noch lückenhaften Datenlage wirksame Kontroll- und Bekämpfungsstrategien. Im ersten Teil der Arbeit (Publikation I) wurde die Überlebensdauer von EC unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen ermittelt. Es wurden ausgesuchte EC-Isolate auf Einstreu, Polyvinylchlorid (PVC) und Staub inokuliert. Die Proben wurden anschließend verschiedenen Temperatur-Luftfeuchtigkeitskombinationen ausgesetzt. Die Überlebensdauer der getesteten EC-Isolate wurde bestimmt, indem zu definierten Zeitpunkten Proben kulturell auf EC überprüft worden sind. Als Temperaturen wurden 37°C, 25°C und 15°C und als relative Luftfeuchtigkeiten 32% relative Luftfeuchtigkeit (RH) und 78% RH ausgewählt. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag auf dem virulenten EC-Isolat EC14. Für einige Parameterkombinationen wurden auch das kommensale Isolat EC13 sowie die zwei weiteren virulenten EC-Stämme EC15 und EC14.2 getestet. Die gemessenen Überlebenszeiten schwankten je nach Parameterkombinationen zwischen 48 h und 4272 h (178 Tage). Im Vergleich überlebten die getesteten EC-Stämme unter den gleichen klimatischen Bedingungen auf Einstreu mit bis zu 4272 h (15°C, 32% RH) länger als auf Staub mit bis zu 2784 h (116 Tage) oder PVC mit bis zu 2280 h (95 Tage). Eine niedrigere Temperatur begünstigte eine längere Überlebenszeit von EC mit einer Differenz von bis zu über 4000 h (über 166 Tage) zwischen den gemessenen Überlebenszeiten bei gleicher Parameterkombination. Bei der relativen Luftfeuchtigkeit zeigte sich eine gewisse Temperaturabhängigkeit. Beispielsweise wurde bei 37°C in Kombination mit 78% RH je nach Trägermaterial eine um bis zu 48 h längere Überlebenszeit als mit 32% RH gemessen. Bei 25°C und 15°C wurde abhängig vom Trägermaterial eine um bis zu über 2600 h (25°C) bzw. über 1800 h (15°C) längere Überlebenszeit in Kombination mit 32% RH als mit 78% RH ermittelt. Die Überlebenszeiten unterschieden sich sowohl zwischen den virulenten Stämmen als auch zwischen den virulenten und dem avirulenten bzw. kommensalen Stamm. Im Vergleich wiesen die virulenten Stämme dabei eine mit mindestens 240 h (10 Tage) längerer Überlebenszeit im Vergleich zum kommensalen Stamm und somit eine höhere Tenazität auf. Die Arbeiten im zweiten Teil (Publikation II) basierten auf zwei Arbeitsansätzen: Im ersten Ansatz wurde ein Broilertränkesystem auf das Vorkommen von Enterococcus spp. und insbesondere von EC untersucht, um das Tränkesystem als potentielle EC-Infektionsquelle zu bewerten. Dazu wurden unterschiedliche Stellen im Tränkesystem eines Masthühnerstalls mittels Tupferproben zu drei verschiedenen Zeitpunkten im Laufe eines Mastdurchgangs beprobt. Als Lokalisationen zur Probenentnahme wurden der Beginn der Tränkelinie, Wasserauffangschalen, Nippel und das Ende der Tränkelinie ausgewählt, sodass eine Aussage zum Vorkommen von Enterokokken und EC entlang des Verlaufs der untersuchten Tränkelinien getroffen werden konnte. Die Beprobung erfolgte an einem Zeitpunkt während der Mastperiode, einem nach der Ausstallung und einem nach erfolgter Reinigung und Desinfektion. Die Tupferproben wurden kulturell auf Enterococcus spp. und in der qPCR auf EC untersucht. Im zweiten Ansatz wurde die Biofilmbildungsfähigkeit in vitro von EC-Isolaten im Vergleich zu E. faecalis- und E. faecium-Isolaten bestimmt. Durch Modifikation eines Biofilmassays für E. faecalis und E. faecium sollte ein EC-Biofilmassay etabliert werden, um im Zusammenhang mit den Ergebnissen des ersten Ansatzes das Broilertränkesystem als mögliches Reservoir und damit Quelle wiederkehrender EC-Infektionen im Stall evaluieren zu können. EC konnte kulturell nicht nachgewiesen werden. Es wurden dennoch diverse andere Enterokokkenarten wie E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. casseliflavus, E. gallinarum und E. villorum im Tränkesystem gefunden und mittels 16S rRNA-Sequenzierung bestätigt. Durch die Untersuchung mittels qPCR konnte jedoch EC-DNA im Tränkesystem detektiert werden. Zum Zeitpunkt am Ende der Mast am 33. Lebenstag konnte die größte EC-DNA-Menge im Vergleich zu den anderen Zeitpunkten nachgewiesen werden. Zu allen Zeitpunkten waren auf den Wasserauffangschalen der Tränkelinien die größten EC-DNA-Mengen zu detektieren. Selbst nach erfolgter Reinigung und Desinfektion war EC-DNA via qPCR noch nachweisbar, insbesondere in den Wasserauffangschalen. Ein in vitro-Biofilmassay für E. faecalis und E. faecium wurde für EC modifiziert, wobei viele verschiedene Parameter wie die Inkubationszeit, die Verdünnung der Bakteriensuspension, der Fixierschritt und weitere Parameter variiert wurden. Für EC und ebenfalls getestete Stämme von E. faecalis und E. faecium konnte in vitro-Biofilmbildung nachgewiesen werden. Dabei schwankte die Stärke der Biofilmbildung für EC von „keine Biofilmbildung“ bis hin zu „starke Biofilmbildung“. Für die Stämme von E. faecalis und E. faecium waren die Schwankungen kleiner und die Ergebnisse entsprachen den Daten über E. faecalis und E. faecium aus der Literatur. In vitro-Biofilmbildung ist demnach für EC möglich und könnte eventuell auch im Broilertränkesystem auftreten.
Since the beginning of the millennium, pathogenic isolates of Enterococcus cecorum (EC) have been known causing the enterococcal spondylitis in broiler chickens. In addition to the increased mortality, the costs of therapy, an increased condemnation rate at the slaughterhouse, and recurrent EC infections in consecutive broiler cycles cause economic damage. Despite the steadily increasing worldwide importance of EC, efficient control strategies are lacking due to a still incomplete data situation. The objective of the first part of the study (Publication I) was to investigate the survival time of EC under different environmental conditions. Selected EC isolates were inoculated onto litter, polyvinyl chloride (PVC) and dust. Samples were then exposed to different temperature-humidity combinations. Survival time of the tested EC isolates was determined examining samples for EC via cultural methods at defined time points. Selected temperatures included 37°C, 25°C, and 15°C and relative humidities contained 32% relative humidity (RH) and 78% RH. The focus of the study was on the pathogenic EC isolate EC14. For some parameter combinations, the commensal isolate EC13 and the two other pathogenic EC strains EC15 and EC14.2 were also tested. The survival times ranged from 48 h to 4272 h (178 days). In comparison, the tested EC strains survived longer on litter with up to 4272 h (15°C, 32% RH) than on dust with up to 2784 h (116 days) or PVC with up to 2280 h (95 days) under the same climatic conditions. Lower temperatures favored a longer EC survival time with a difference of up to more than 4000 h (over 166 days) between the measured survival times at the same parameter combination. The effect of relative humidity showed some temperature dependence. For example, the survival time at 37°C in combination with 78% RH was measured to be up to 48 h longer than with 32% RH, depending on the substrate. At 25°C and 15°C, depending on the substrate, a survival time longer by up to more than 2600 h (25°C) and more than 1800 h (15°C), respectively, was determined in combination with 32% RH compared to 78% RH. Survival times differed both between pathogenic strains and between pathogenic and commensal strains. The virulent strains showed a longer survival time of at least 240 h (10 days) and thus a higher tenacity compared to the commensal strain. The second part (Publication II) had two objectives: The first objective was to investigate a broiler drinking system for the presence of Enterococcus spp. and in particular EC, to evaluate the drinking system as a potential source of EC infection. Different locations in the drinking system of a broiler house were sampled by swabs at three different time points during a broiler cycle: As locations, the beginning of the drinking line, drinking cups, nipples, and the end of the drinking line were selected, to assess the occurrence of enterococci and EC along the examined drinking lines. Sampling was performed during the fattening period, after the removal of the animals, and after completed cleaning and disinfection. Swab samples were analyzed via cultivation for Enterococcus spp. and via qPCR for EC. The second objective was to determine the biofilm formation ability of EC isolates in vitro in comparison to E. faecalis and E. faecium isolates. A biofilm assay for E. faecalis and E. faecium was modified to establish an EC biofilm assay. Thereby, in connection with the results of the first objective, the broiler drinking system was evaluated as a possible reservoir and source of recurrent EC infections. No EC was detected by cultural isolation. Nevertheless, various other enterococci species such as E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. casseliflavus, E. gallinarum and E. villorum were detected in the drinking system and confirmed by 16S rRNA sequencing. However, by examination by qPCR, EC DNA was found in the drinking system. At the end of the fattening period at day 33 of age, the greatest amounts of EC DNA were detected compared to the other time points. At all time points, the greatest amounts of EC DNA were found on the drinking cups of the drinking lines. Even after cleaning and disinfection, EC DNA was still detectable via qPCR, especially on the drinking cups. An in vitro biofilm assay for E. faecalis and E. faecium was modified for EC, different parameters such as incubation time, bacterial dilution, fixation step, and others were varied. In vitro biofilm formation was detected for EC as well as for tested strains of E. faecalis and E. faecium. EC biofilm formation ranged from “no biofilm formation” to “strong biofilm formation”. For the strains of E. faecalis and E. faecium, the variations of biofilm formation were smaller and the results were consistent with data on E. faecalis and E. faecium from the literature. Consequently, in vitro biofilm formation is possible for EC and could possibly occur in the broiler drinker system.
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