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Development of alternative approaches for preserving equine spermatozoa

Cryopreservation is the most widely used method to preserve equine spermatozoa for prolonged periods. Cryopreserved samples can be stored in sperm-biobanks and making sperm samples available to breeders around the globe. Conventional cryopreservation requires relatively low concentrations (up to 5% v/v) of cryoprotective agents such as glycerol and controlled freezing at a defined species-specific cooling rate (ranging from 0.1–50°C min–1 ). Samples can be stored for extended/long periods in liquid nitrogen (i.e., −196°C). Viability losses of cryopreserved sperm samples can be attributed to osmotic imbalances and mechanical stress caused by extracellular (and/or intracellular) ice formation (Mazur, 1963). Since ice formation rather than the exposure to low temperatures is the main cause of cryopreservation damage, it was investigated here if vitrification can serve as an alternative sperm preservation method. Moreover, the feasibility of storing sperm samples in a supercooled state was investigated here by diminishing the incidence of surface catalyzed ice nucleation events at storage temperatures well below the equilibration freezing point of the sample. In addition, it was investigated if sperm encapsulation in alginate microstructures stabilizes sperm during hypothermic storage and provides additional protection during freezing. For preservation of sperm at subzero temperatures, addition of protective compounds is needed, which can be membrane permeating or non-permeating agents or a combination thereof. At high concentrations, cryoprotectants typically become toxic, since they expose cells to osmotic stress and affect membrane integrity (Sieme et al., 2016). Oocytes are commonly cryopreserved using vitrification (Rienzi et al., 2017), whereas sperm is typically cryopreserved using controlled slow cooling protocols. Sperm vitrification protocols, however, have been employed for several species including horses. In a vitrified state, sperm is immobilized in a glassy state, in which molecular movement and the cellular metabolism is slowed down. In chapter 2 it was shown that equine spermatozoa can be vitrified, when depositing as droplets of 20 µL on a solid surface method kept in liquid nitrogen. For this approach a relatively high concentration of permeating agents needed to be added to the sperm samples, namely 45% (v/v) GLY/PG. To minimize toxicity effects, a double syringe-high throughput system was used for stepwise addition of the CPA solution. Sperm was initially diluted in diluent with a low concentration of CPA-mixture, for subsequent mixing (and a minimum exposure duration) with the actual vitrification containing a high CPA concentration. During exposure to high CPA concentrations, cells dehydrated. In contrast to oocytes, sperm contain a relatively small amount of free water which likely makes them more sensitive to dehydration/vitrification (Drevius, 1972). The additional advantage of the controlled syringe system was that the mixing process occurred at a controlled/constant rate, and large quantities of droplets of a uniform size could be easily produced. Moreover, since droplets were deposited on a pre-cooled aluminum block, actual vitrification could be inspected visually by means of the opacity of the droplets similarly as described before (Akiyama et al., 2019). In addition, vitrification was confirmed using cryo-electron microscopy (Huebinger et al., 2016; Bóveda et al., 2020). Cryopreservation in the absence of ice resulted in increased numbers of membrane intact sperm after warming as compared to specimens subjected to solid surface vitrification in diluents that did result in ice formation. In chapter 3, sperm viability during supercooled storage was investigated. The supercooled state is attained when ice nucleation does not occur at sub-zero temperatures below the freezing point of a particular solution. Which determined which fluid composition possibly allowed for supercooled storage of sperm, namely buffered saline supplemented with 2% Ficoll-400 while being covered with an oil layer. Eventually supercooled storage of sperm was investigated using 3.5 mL samples, for 7 days at −10°C. After defining conditions that allowed for supercooled storage of sperm, sperm membrane integrity and motility was investigated during storage. In samples containing ice due to nucleation no motile nor membrane intact sperm could be recovered. By supplementing specimens with milk components, motility could be restored to some extent for specimens that maintained in a supercooled state during storage. In chapter 4, possible beneficial effects of encapsulating sperm in alginate structures were investigated. Both, sperm viability during storage in core-shell and solid alginate structures were tested, while biocompatibility of the compounds needed for alginate gelation/capsule formation was first tested. It was found that alginate-encapsulated sperm holds great promise; and encapsulation in core-shell structures appears more suitable for storage at refrigerated temperatures, while encapsulation in solid beads may be more suitable for cryopreservation and frozen storage. The less dense/more permeable core-shell alginate structures allow for exchange of cell metabolism products from within the structures to the surrounding medium, as well as fresh nutrients from medium towards the sperm residing in the capsule structures. Such exchange may be less pronounced in case of more compact/dense bead structures. Solid beads, however, may be more resistant to mechanical stress as occur during cryopreservation/ice formation. Also, alginate core-shell structures have been employed for controlled/slow release of sperm in the female reproductive tract close to where ovulation takes place (Torre et al., 2000). For use with sperm, alginate gelation using barium is preferred above using calcium, since calcium plays a role in inducing sperm capacitation (Yanagimachi and Usui, 1974; Breitbart, 2002). Furthermore, alginate products formed by barium are more stable as compared to using calcium. This is explained by barium displaying a higher affinity to the alginate guluronic residues (Faustini, 2011). Cooling as well as freezing expose sperm to stress, and such protocols that involve such processes ask for taking protective measures. The vitrification as well as supercooling protocols described in the current study, made use of media supplemented with sucrose. As described above, sucrose is a disaccharide similarly as trehalose, which both have been described to reduce the ice nucleation temperature (Pérez-Marín et al., 2018). In addition, when lowering the temperature/in the presence of ice, membrane permeability to water is increased, resulting in a lower probability of intracellular ice formation (Gläfke et al., 2012). Increasing sucrose concentrations also result in an increase of the viscosity of a solution therewith possibly facilitating vitrification. For vitrification, often a combination of albumin and sucrose is used. Albumin addition causes an increase of the strength of hydrogen bonding interactions affecting the relaxation properties in the glassy state (Roos and Karel, 2007). Tg is generally related to the physical stability of glasses (Simperler et al., 2006; Alhalaweh et al., 2015). Furthermore, molecular mobility in the glassy state has been escryibed to be correlated to hydrogen-bonding-strength interactions and storage stability (Sydykov, 2018). Generally, the amount of protective agents needed for preserving a particular sample is dependent on the size of the sample as well as physical properties of the protective agents used. We found that both for vitrification and supercooling of sperm samples, the sperm concentration that was used greatly affected the outcome (i.e., survival after warming/during storage). For alginate encapsulation the employed sperm concentration did not appear to play an important role. We anticipate that the relative sperm-CPA ratio plays an important role with vitrification. In case of supercooling (and vitrification), the irregularly shaped sperm may act as nucleation points, therewith increasing the incidence of ice formation. The use of cleaned solutions and degassed samples have been described to reduce the probability of ice nucleation (Huang, Yarmush and Usta, 2018), nevertheless addition of sperm renders these preparations obsolete. Both, after vitrification-and-warming and supercooled storage, we found that sperm motility was drastically reduced as compared to specimens that were subjected to ordinary cryopreservation or refrigerated storage. No beneficial effects were seen for diluents containing low sodium concentrations i.e., in case of substituting sodium with choline chloride. Cryopreservation has been described to cause an increase in the sodium content of spermatozoa, which likely leads to a reduction of the ATP-pump-activity which may explain the observed reduced motility after cryopreservation/vitrification (Torres-Flores et al., 2011; Ortega Ferrusola et al., 2017). It should be noted that despite the loss of sperm motility, sperm can be used for intracytoplasmatic sperm injection (ICSI), i.e., when having intact DNA (Hinrichs, 2005). Alginate itself has been found to have a negative impact on sperm motility, due to its high viscosity. Upon gelation (i.e., alginate reacting with divalent calcium or barium ions), however, such an effect is not seen. For other species alginate encapsulation has been described to have no negative effects on sperm fertility (Kemmer et al., 2011). Equine sperm motility of encapsulated sperm did not decline during storage for up to 4 days, so a loss of fertility could not be expected.

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Untersuchung möglicher neuer, alternativer Konservierungs- und Lagerungsmethoden für Pferdesperma. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf Methoden gelegt, bei denen Lagerungstemperaturen unterhalb von 0° C, bei gleichzeitiger Vermeidung von Eisbildung erreicht werden. Bei diesen Temperaturen wird die Stoffwechselrate des Spermiums und die Beeinträchtigungen, die mit dem Phasenübergang von Wasser zu Eis verbunden sind, reduziert. Die Methoden beinhalten das Untersuchen der Vitrifikation von Spermien, mit Verwendung von permeablen Kryoprotektiva (CPA), bei Lagerung in ultratiefen Temperaturen (-196 °C), sowie das Supercoolen von Spermien bei moderaten Minustemperaturen (-10 °C). Darüber hinaus wurden mögliche positive Auswirkungen einer zusätzlichen Alginatverkapselung untersucht. In Kapitel 2 wurde ein Gerät entwickelt, mit dem in einer kurzen Zeit viele, gleichförmige Tropfen für die Vitrifikation auf einer festen Oberfläche erzeugt werden können. Dabei wurde ein Zwei-Spritzen System verwendet, um die Spermien der final hohen und damit potenziell toxischen CPA-Konzentration nur für eine kurze Zeit auszusetzen. Mithilfe einer Computermodulation wurde die theoretische Kühlrate und Temperaturverteilung innerhalb der Tropfen berechnet. Außerdem wurden experimentell die Rahmenbedingungen der Tropfengröße und des CPA-Einflusses auf die Vitrifikation untersucht. Insgesamt vitrifizieren kleinere Tropfen bereits mit geringeren CPA-Konzentrationen. Der Vitrifikationserfolg kann durch Verwendung einer salzigen Lösung als CPA-Träger noch erhöht werden. Der Einfluss dieser hochkonzentrierten CPAs auf Spermien wurde im Anschluss getestet, Konzentrationen von bis zu 20 % (v/v) werden ohne größere Einbußen vertragen, wenn auch nur für eine begrenzte Zeit. Fortschreitende Inkubationsdauern führen zu vermehrten Beeinträchtigungen der Spermien. Im Gegensatz zu Eizellen macht es bei Spermien keinen Unterschied, ob Natrium-Chlorid durch Cholin-Chlorid ersetzt wird. Positiv stellten sich jedoch die Mischungen von CPAs auf die Membranverträglichkeit heraus, auch wenn für den gleichen Vitrifikationserfolg ~2 % höhere Konzentrationen dieser Mischungen genutzt werden mussten. Vitrifizierte Tropfen wurden in einer vorgewärmten Spermienverdünnerlösung aufgewärmt, unter Verwendung verschiedener Protokolle des Saccharosezusatzes und folgender Entfernung. Kein Zusatz von Saccharose bzw. das komplette Entfernen nach dem Aufwärmen, führte nicht zu den gleichen, erfolgsversprechenden Ergebnissen wie das schrittweise Verdünnen der Saccharose im Aufwärmprozess. Mit geringen Spermienkonzentrationen war eine höhere Ausbeute membranintakter Spermien nach Aufwärmen zu verzeichnen, bei einer Konzentration von 0,1x106 Spermien ml-1 und schrittweiser Verdünnung der Saccharose nach dem Auftauen war kein Verlust, im Vergleich zu der Ausgangsprobe, festzustellen. Es wurde der Nachweis geführt, dass dieser Erfolg durch Verhindern der Eisbildung möglich war. Mithilfe von Cryo-Elektronenmikroskopaufnahmen wurde ebenfalls bewiesen, dass keine Eisbildung in den vitrifizierten Proben stattfand. In Kapitel 3 wurden Spermien ebenfalls ohne Vorhandensein von Eis auf eine Temperatur unter 0 °C gebracht, allerdings in einem anderen physikalischen Zustand. Zuerst wurden mehrere Lösungen, Zusätze und ihre Kombinationen auf ihre Fähigkeit zum Supercooling untersucht, ebenso wie der Einfluss von Spermien auf die Inzidenz der Eiskristallbildung und der Einfluss verschiedener Öle als Oberflächenversiegelung. Ein Medium mit 2 % Ficoll-400 in HBS, Zusatz von Saccharose und Oberflächenversiegelung mit einem mineralischen Öl erwies sich als das am besten geeignete Supercoolingverfahren. Spermien lösen konzentrationsabhängig Eiskristallbildung aus, sodass auch hier wieder mit geringen Konzentrationen, ebenso wie bei der Vitrifikation, gearbeitet wurde. Im Folgenden konnten dann Pferdespermien für 7 Tage bei einer Temperatur von -10 °C erfolgreich ohne Eiskristallbildung gelagert werden. Dabei wurde visuell und mechanisch auf Vorhandensein von Eis geprüft. Im Vergleich von Supercooling-Proben gegen Gefrorene, wurden deutlich mehr membranintakte Spermien in den Supercool-Proben nachgewiesen. Auch hier war das Fehlen der Eiskristalle für den erfolgreichen Konservierungsprozess verantwortlich. Ein Abfall der Membranintegrität im Verlauf der Lagerung konnte erst nach einer Lagerungsdauer von 96 Stunden beobachtet werden. Im Vergleich dazu, zeigten die getesteten Lösungen bei 5 °C keine negativen Effekte auf die Spermien. Als Alternativen für vergleichsweise physiologisch neutrales HBS wurden eine stark zuckerhaltige Lösung und eine Lösung mit Magermilchpulveranteilen eingesetzt. Die stark zuckerhaltige Lösung konnte nur kurzfristig die Motilität nach dem Supercooling erhalten, während bei Verwendung milchpulverhaltiger Lösung ein über den Versuchszeitraum stabiler Anteil an motilen Spermien gemessen wurde.  In Kapitel 4 wird beschrieben, wie Spermien eingekapselt werden können, um sie vor potenziellen Noxen aus der Umwelt zu schützen. Hier wurden Spermien mit zwei verschiedenen, zweiwertigen Ionen in diversen Verkapselungsmethoden mit Alginat bearbeitet. Es wurde festgestellt, dass eine Auswirkung der Ionen auf die Motilität bereits bei Konzentrationen von 10 mM beginnt, während die Membranen erst bei Konzentrationen von 50 mM beeinträchtigt werden. Im Allgemeinen hatte Kalzium eine geringere Wirkung auf die Spermien, bildete aber auch schwächere Bindungen mit den Alginaten, sodass die Kapseln die mechanischen Anforderungen nicht erfüllten. Außerdem wird Kalzium als ein Faktor für den Kapazitationsprozess der Spermien angesehen, weshalb letztendlich erfolgreich Barium verwendet wurde. Alginat selbst hatte keinen Einfluss auf die Membranintegrität, behinderte aber aufgrund seiner hohen Viskosität in ungebundener Form deutlich die Motilität der Spermien. Die mit Barium gebildeten Kapseln mit Flüssigkern waren als einzige der getesteten Varianten in der Lage, die Motilität über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen auf dem Niveau einer verdünnten Spermaprobe zu erhalten. Dabei spielte die Flüssigkeit über den Kapseln eine wesentliche Rolle: Durch Verwendung einer nährstoffreichen Flüssigkeit waren die Motilitätswerte nach der Lagerung besser als bei Verwendung einer nährstoffarmen Lösung, die Semipermeabilität der Kapseln wurde hierdurch bewiesen. Solange das Abkühlprotokoll aus dem konventionellen Spermieneinfrierprogramm genutzt wurde, ließen sich auch Kapseln mit Spermien erfolgreich einfrieren und auftauen. Die Motilität nach dem Auftauen war jedoch geringer im Vergleich zu konventionell bearbeitetem Sperma. Es wurde gezeigt, dass eiskristallfreie Konservierungsmethoden eine Möglichkeit darstellen, Pferdesperma über einen längeren Zeitraum zu konservieren. Allerdings müssen die Methoden und Verfahren selbst weiter verbessert und angepasst werden, um wettbewerbsfähige Ergebnisse zu erzielen. Der Schutz von Pferdespermien durch Verkapselung wurde ebenfalls erfolgreich getestet und kann, nach weiterer Verfeinerung des Prozesses, möglicherweise eine Verbesserung der Kryokonservierung in Kombination mit den zuvor beschriebenen eisfreien Optionen darstellen



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