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Influence of genetic adaptation to vector populations on arbovirus emergence and spread

Favoured by increasing climatic and environmental changes, as well as global travel and trade, previously non-endemic arthropod-borne viruses (arboviruses) have been able to spread across Europe. In addition to the possibility of endemic vectors becoming susceptible to non-endemic viruses, highly potent and formerly exotic vectors like Aedes aegypti and Aedes albopictus are steadily expanding their ecological niches to more temperate regions within Europe. Because arboviruses alternate between a hematophagous arthropod vector and a susceptible vertebrate host, they need to quickly adapt to drastic environmental changes. One of the largest orders of viruses, the Bunyavirales,comprises over 470 different viral species, a large part of those being arboviruses. Many bunyaviruses (members of the Bunyavirales) can cause disease in humans and livestock alike and are therefore called zoonotic viruses. Bunyaviruses are classified by a segmented, mostly tripartite, negative sense, single-stranded RNA genome. The nature of their segmented genome is the prerequisite for genomic reassortment, a process that involves the exchange of genetic segments of two closely related viruses during co-infection of a single host cell. Viral reassortment is often accompanied by an altered pathogenicity, host range, and/or vector susceptibility. A good example of the drastic influence of viral reassortment on the above-mentioned viral characteristics is the Ngari virus (NRIV). NRIV is a Bunyamwera orthobunyavirus (BUNV) reassortant that incorporates the Batai orthobunyavirus (BATV) medium (M) segment. Even though both parental viruses are known to usually cause self-limiting, febrile illness in humans, NRIV has been associated with outbreaks of haemorrhagic fever. BUNV, the type species of the Bunyavirales, has been the subject of extensive research since its first isolation in the 1940s. BATV however, although considered to be the most widespread member of the genus Orthobunyavirus, has been severely understudied.

The first part of this thesis aims to investigate the potential for viral reassortment of BUNV and BATV after in vitro co-infection of mammalian and insect cells. We were able to demonstrate viral reassortment of BUNV and BATV in BHK-21 cells, which contradicts previous research, suggesting reassortment occurs in the insect vector. We isolated two virus reassortants, the first of which exhibiting the same segment composition as the naturally occurring NRIV (due to the different geographical origin of the BATV M segment, referred to as Ngari-like). Interestingly, the second isolated virus was a BATV reassortant that incorporates the BUNV L segment (referred to as Batunya virus, BAYAV). According to the literature, this constitutes only the second non-M segment reassortant bunyavirus. Viral growth kinetics revealed distinct differences between the parental and reassortant viruses, but also between Ngari-like and BAYAV.

Therefore, in the second part of this thesis we investigated the role of C-type lectins (CTLs) during BATV infection. CTLs are a large group of pattern recognition receptors, that play an important role within the innate immune system of vertebrates as well as arthropods. We provided first evidence for the involvement of DC-SIGN and Mincle during BATV infection, two CTLs that are already known to be involved in the recognition of other bunyaviruses. These experiments are still ongoing and require further investigation.

Since knowledge on BATV is vastly incomplete and increasing evidence suggests a continuous spread of the virus across Germany, the third part of this project aims to establish a T7-based reverse genetics system. Even though rescue attempts have been unsuccessful so far, such a system would provide a valuable tool, not only to investigate the molecular characteristics of BATV, but it would also allow for targeted reassortment experiments without the need for time-consuming and chance-dependent co-infections if combined with the reverse genetics systems for BUNV.

Begünstigt durch zunehmende klimatische und ökologische Veränderungen sowie durch internationale Reisen und Handel, kommt es zu einer ansteigenden Ausbreitung von nicht-endemischen Arthropoden-übertragenen Viren („Arboviren“) in Europa

Neben der Gefahr das einheimische Vektoren empfänglich für nicht-endmische Viren werden, erweitern hochpotente und ehemals exotische Vektoren wie Aedes aegypti und Aedes albopictus stetig ihre ökologischen Nischen in den gemäßigten Regionen Europas. Da Arboviren zwischen einem blutsaugenden Arthropoden-Vektor und einem empfänglichen Wirbeltier-Wirt alternieren, müssen sie in der Lage sein, sich schnell wechselnden Umweltbedingungen anzupassen. Eine der größten Ordnungen innerhalb der Viren, mit über 470 verschiedenen Spezies, sind die Bunyavirales. Ein Großteil davon sind Arboviren. Viele Bunyaviren (Viren der Ordnung Bunyavirales) lösen sowohl in Menschen als auch in Nutztieren Krankheiten aus und werden deshalb als zoonotische Viren bezeichnet. Charakteristisch für Bunyaviren ist ihr überwiegend dreiteilig segmentiertes, negativ-orientiertes und einzelsträngiges RNA Genom. Das segmentierte Genom ist die Vorrausetzung für den Prozess der genomischen Reassortierung, bei welchem Gensegmente zweier engverwandter Viren während der Co-Infektion einer einzelnen Wirtszelle ausgetauscht werden können. Virale Reassortierung geht oft mit einer veränderten Pathogenität, einem erweitertem Wirtspektrum, und/oder einer veränderten Vektorkompetenz einher. Ein Beispiel für den drastischen Einfluss die virale Reassortierung auf die eben erwähnten Eigenschaften haben kann, ist das Ngari Virus (NRIV). NRIV ist eine Bunyamwera orthobunyavirus (BUNV) Reassortante, die das mittlere (M) Batai orthobunyavirus (BATV) Segment in ihr Genom integriert hat. Obwohl beide Ursprungsviren nur dafür bekannt sind selbstlimitierende, fieberhafte Erkrankung beim Menschen auszulösen, wurde NRIV mit Ausbrüchen von hämorrhagischem Fieber in Verbindung gebracht. BUNV, die Typspezies der Bunyavirales, ist seit seiner ersten Isolierung in den 1940er Jahren Gegenstand umfangreicher Forschungen. BATV hingegen, obwohl es als das weitverbreitetste Mitglied der Orthobunyaviren gilt, ist kaum erforscht.

Der erste Teil dieser Arbeit fokussiert sich auf die Untersuchung des Potentials zur viralen Reassortierung von BUNV und BATV nach einer in vitro Co-Infektion in Säuger- und Insektenzellen. Wir konnten virale Reassortierung von BUNV und BATV nur in BHK-21 Zellen demonstrieren, was dem bisherigen wissenschaftlichen Stand widerspricht, da Reassortierung bisher nur in Insekten beschrieben wurde. In den Versuchen wurden zwei Virus Reassortanten isoliert, wovon eine der beiden dieselbe Segmentzusammenstellung wie das natürlich vorkommende Ngari Virus (auf Grund des geographischen Ursprungs des BATV M Segmentes als Ngari-like bezeichnet) besitzt. Interessanterweise ist das zweite Isolat eine BATV Reassortante, die das BUNV L Segment integriert hat (weiterhin als Batunya Virus, BAYAV bezeichnet). Es handelt sich hierbei erst um die zweite nicht-M Segment Reassortante innerhalb der Bunyaviren. Wachstumskinetiken aller vier Viren haben klare Unterschiede zwischen den Elternviren und beiden Reassortanten, jedoch auch zwischen Ngari-like und BAYAV aufgezeigt.

Um die beschriebenen Unterschiede näher zu untersuchen, befasst sich der zweite Teil dieser Arbeit mit der Rolle von C-Typ Lektinen (CTL) während einer Infektion mit BATV. CTL sind eine große Gruppe von Pattern Recognition Receptors (PRRs), welche eine wichtige Rolle innerhalb der angeborenen Immunantwort von Wirbeltieren und Arthropoden übernehmen. Von anderen Bunyaviren ist bereits bekannt, dass CTL wie DC-SIGN und Mincle eine Rolle in der viralen Erkennung haben. Wir konnten nun erstmalig beweisen, dass diese CTL an einer Infektion mit BATV beteiligt sind. Aktuell laufende Studien werden diesen Effekt tiefergehend charakterisieren und mögliche weitere CTL herausarbeiten.

Auf Grund dessen, dass unser Wissen über BATV nur sehr begrenzt ist und neuste Untersuchungen für eine weitere Verbreitung des Virus innerhalb Deutschlands sprechen, befasst sich der dritte Teil dieses Projekts mit der Entwicklung eines T7-bassierten Reverse Genetik Systems für BATV. Auch wenn es uns bisher nicht gelungen ist, replikationsfähiges BATV mit diesem System so generieren, so stellt es doch ein nützliches Werkzeug bei der Erforschung der molekularen Eigenschaften von BATV dar. Des Weiteren erlaubt es gezielte Reassortierungs-Experimente, ohne auf zeitaufwändige und vom Zufall abhängige Co-Infektionen angewiesen zu sein, wenn man es mit dem bereits existierenden Reverse Genetik System für BUNV kombiniert.

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