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Improved methods for the inactivation and serological surveillance of emerging flaviviruses in Europe

Viruses of the family Flaviviridae include some of the most important arthropod-borne viruses, like dengue virus (DENV), West Nile virus (WNV) and tick-borne encephalitis virus (TBEV). In the last years, an extensive global spread as well as an emergence of flaviviruses in different parts of the world has been observed. As flaviviruses infect several hundred million people annually, there is a high need for a deeper understanding of the viruses’ biology and the immune responses induced by these viruses. This thesis established methods that will facilitate further flavivirus research and surveillance.

One objective of this thesis was to establish and improve TBEV inactivation methods that enable analyses of virus samples for the purpose of functional flavivirus research. This study evaluated minimal incubation times and concentrations for a safe inactivation of infectious TBEV particles that minimally interfere with downstream analyses. The previously very limited number of approved inactivation methods for TBEV was extended to a variety of procedures, including inactivation by heat, UV irradiation, alcohol, low pH and detergents. The results of these studies compare well with published data on inactivation procedures of related flaviviruses, showing that flaviviruses have similar susceptibility to different inactivation procedures. Nevertheless, differences in minimal incubation times and concentrations of the substances show that methods need to be validated under specific conditions.

The objective of the second part of this thesis was the establishment of a new method for flavivirus serology. For this purpose, a species-independent luciferase immunoprecipitation system (LIPS) antibody detection assay was developed. The LIPS assay is applicable for the detection of antibodies against several TBEV and WNV antigens. The sensitivity is higher than in commercial enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and shows comparable sensitivity and specificity to virus neutralization assays. Therefore, LIPS is demonstrated to be a good alternative for currently used serum neutralization tests (SNTs). Furthermore, a serological discrimination between TBEV and WNV based on antibodies against the non-structural protein 1 (NS1) is possible. The LIPS assay is suitable for the detection and differentiation of TBEV and WNV in serum samples from different hosts and will facilitate differential serology of flaviviruses for epidemiological research.

The third part of this thesis contains a contribution to the epidemiology and surveillance of European flaviviruses. Therefore, samples from different animal hosts were tested for antibodies against TBEV and WNV. The presence of TBEV-specific antibodies was detectable in canine samples from Germany, Czech Republic and Hungary, whereas the presence of WNV-specific antibodies was detected in canine samples from Hungary and Romania. This confirms the distribution of TBEV and WNV across different European countries. Furthermore, for TBEV a spread to Northern and Western Germany, creating new endemic areas, was observed. In our studies, the detection of specific antibodies against TBEV was possible in dogs and small ruminants, suggesting their potential use as sentinel species for surveillance in non-endemic areas.

In summary, this thesis established different methods that will facilitate future flavivirus research. These studies make a contribution to the scientific progress on virus infectivity, antibody responses in different hosts and the geographical distribution of different European flaviviruses.

Die Familie der Flaviviridae umfasst einige der wichtigsten durch Arthropoden übertragene Viren, wie Dengue-Virus (DENV), West-Nil-Virus (WNV) und Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV). In den letzten Jahren wurde sowohl eine großflächige globale Ausbreitung sowie auch das Neuauftreten von Flaviviren in unterschiedlichsten Teilen der Welt beobachtet. Da Flaviviren jährlich mehrere hundert Millionen Menschen infizieren, ist die Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses der Virusbiologie und der Immunantwort gegen diese Viren sehr hoch. Im Rahmen dieser These wurden Methoden etabliert, die die weitere Forschung und Überwachung von Flaviviren erleichtern sollen.

Ein Ziel dieser These war die Etablierung und Verbesserung von FSMEV Inaktivierungsmethoden zur Analyse von Virusproben in der Flavivirusforschung. In dieser Studie wurden minimale Inkubationszeiten und Konzentrationen ermittelt, die zur sicheren Inaktivierung infektiöser FSME-Viruspartikel führen, ohne die nachfolgenden Analysen negativ zu beeinflussen. Die zuvor sehr limitierte Anzahl anerkannter Inaktivierungsmethoden für FSMEV wurde um eine Vielzahl an Prozeduren erweitert, einschließlich der Inaktivierung mittels Hitze, UV-Strahlung, Alkohol, saurem pH und Detergenzien. Die Resultate dieser Studien zeigen eine hohe Übereinstimmung mit publizierten Daten zur Inaktivierung verwandter Flaviviren. Dies zeigt eine vergleichbare Empfänglichkeit der unterschiedlichen Flaviviren für verschiedene Inaktivierungsmethoden. Unterschiede in benötigten Inkubationszeiten und Konzentrationen zeigen aber, dass Methoden unter spezifischen Bedingungen validiert werden müssen.

Das Ziel des zweiten Teils dieser These war die Etablierung einer neuen Methode zum serologischen Nachweis von Flaviviren. Zu diesem Zweck wurde ein speziesunabhängiger Luziferase Immunopräzipitationssystem (LIPS) Assay zur Antikörpererkennung entwickelt. Der LIPS Assay erwies sich als geeignet, um Antikörper gegen verschiedene spezifische Antigene von FSMEV und WNV zu detektieren. Die Sensitivität des LIPS Assays ist höher als die kommerzieller Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) und zeigt eine vergleichbare Sensitivität und Spezifität wie Neutralisationsassays. Daher scheint LIPS eine gute Alternative zu derzeit verwendeten Virus-Neutralisationstests (VNTs) darzustellen. Weiterhin ist eine serologische Unterscheidung zwischen FSMEV und WNV anhand des Nichtstrukturproteins 1 (NS1) möglich. Der LIPS Assay eignet sich daher für die Detektion und Differenzierung von FSMEV- und WNV-spezifischen Antikörpern in Serumproben unterschiedlicher Wirte und ist somit in der Lage den spezifischen Nachweis von Flaviviren in der epidemiologischen Forschung zu erleichtern.

Der dritte Teil dieser These beinhaltet einen Beitrag zur Epidemiologie und Überwachung der Verbreitung europäischer Flaviviren. Dafür wurden Proben von verschiedenen tierischen Wirten auf Antikörper gegen FSMEV und WNV untersucht. FSMEV-spezifische Antikörper waren in Hundeproben aus Deutschland, Ungarn und Tschechien nachweisbar, wohingegen in Hundeproben aus Ungarn und Rumänien WNV-spezifische Antikörper nachweisbar waren. Dies bestätigt die Verbreitung von FSMEV und WNV in verschiedenen europäischen Ländern. Weiterhin konnte für FSMEV eine Ausbreitung nach Nord- und Westdeutschland gezeigt werden, die zur Etablierung neuer endemischer Gebiete geführt hat. In unseren Studien war die Detektion spezifischer Antikörper gegen FSMEV in Hunden und kleinen Wiederkäuern möglich. Dies zeigt die Möglichkeit der Verwendung dieser Arten als Sentineltiere für die Überwachung der Ausbreitung von FSMEV in Gebieten mit geringem Infektionsrisiko.

Zusammenfassend wurden im Zuge dieser These verschiedene Methoden etabliert, die die zukünftige Forschung an Flaviviren erleichtern können. Diese Studien leisten einen Beitrag zum wissenschaftlichen Fortschritt in den Bereichen der Virusinfektiösität, der Detektion von Antikörperantworten in verschiedenen Wirten und der geografischen Verbreitung unterschiedlicher Flaviviren.

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