Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Host cell responses and protein-protein interactions in tick-borne encephalitis virus infection

Tick-borne flaviviruses (TBFV), members of the Flaviviridae family, are transmitted by either tick bite or consumption of raw milk products from infected ruminants. In severe infections, the viruses enter the central nervous system (CNS), leading to neural inflammation and causing neurological complications, such as encephalitis, meningitis or meningoencephalitis. Differences in tissue tropism and pathogenicity have been described for individual virus species and strains. Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is the most important tick-borne virus in Europe and Asia. Despite increasing numbers of TBE cases due to geographical expansion of TBEV and its vectors, specific antiviral treatments are still lacking. Therefore, this thesis aimed to contribute to our understanding of cellular processes involved in TBEV infection to facilitate the identification of new therapeutic targets.

Flavivirus genomes consist of single-stranded positive-sense RNA that encodes a single open reading frame comprising ten viral genes. Three structural proteins and seven non-structural proteins are expressed as a single polyprotein that is co-and post-translationally cleaved by viral and host proteases. This mode of protein translation has limited the study of individual TBEV proteins. To investigate the distribution, function and molecular interactions of each viral protein as part of this thesis, all TBEV genes were cloned and expressed individually. Molecular interaction studies of the viral proteins revealed the formation of dimers and oligomers, as well as interactions between individual viral proteins. Finally, the recombinant TBEV proteins were used to perform a mass spectrometry screen to generate a complete host interactome of all TBEV proteins.

Within the infected cell, flaviviruses utilize the host cell machinery for facilitating their own replication, triggering cellular stress responses, that include the unfolded protein response (UPR). The IRE1 pathway increases protein folding capacity and lipid biogenesis and was hypothesized to support flavivirus replication. As part of this thesis, we infected human astrocyte, neuronal and intestinal cell lines with TBEV strains Neudoerfl and HB171 as well as Langat virus (LGTV) to investigate to role of the UPR in TBFV infection. The virus replication within the different cell lines correlated with the naturally observed tropism of the analyzed virus species. Furthermore, all three viruses activated the IRE1, although with strain-specific differences. Lastly, the role of IRE1 signaling on TBFV replication was analyzed by inhibiting different enzymatic activities of IRE1. Remarkably, the inhibition of both, the kinase and RNase activities of IRE1 resulted in a significantly reduced TBFV infection in astrocytes. Taken together our results suggest a possible role of the UPR in astrocytes in the neuropathology of TBE.

Within the CNS, neurotropic flaviviruses like TBEV, infect different brain-resident cell subsets such as microglia or astrocytes, that are involved in neuroprotection by mounting an immune response to restrict virus dissemination. Upon TBEV infection, the viral single-stranded RNA is recognized by retinoic acid inducible gene I-like receptors (RLR), which induce early type I interferon (IFN) responses by signaling downstream through the adaptor molecule mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS). As part of this thesis, we aimed to identify the major IFN-β producing brain-resident cell subset upon TBEV infection. Murine neurons, astrocytes, and microglia were isolated and exposed to TBEV in vitro, revealing astrocytes are the main IFN-β producers among brain-resident cell subsets in response to TBEV infection. Furthermore, the induced IFN-β response consisted of two waves that depend on sequential MAVS signaling during early time points and MyD88/TRIF signaling at later stages of infection.

In conclusion, the work presented in this thesis revealed novel host factors and cellular processes that directly interact with individual TBEV proteins. Furthermore, cellular signaling pathways, such as those involved in UPR and IFN responses, present potential targets for therapeutic interventions. A better knowledge of the complex roles of these pathways in the specialized milieu of the CNS is required to address the therapeutic need in neurotropic flavivirus infections.

Durch Zecken übertragene Flaviviren der Familie Flaviviridae werden entweder durch Zeckenstiche oder den Verzehr von Rohmilchprodukten von infizierten Wiederkäuern übertragen. In schweren Infektionsverläufen gelangen die Viren in das zentrale Nervensystem (ZNS), wo sie eine Entzündung des Gehirns und neurologische Komplikationen wie Enzephalitis, Meningitis oder Meningoenzephalitis hervorrufen können. Für unterschiedliche Virusstämme wurden Unterschiede im Gewebetropismus und in der Pathogenität beschrieben.  Das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV) ist das am häufigsten durch Zecken übertragene Virus in Europa und Asien. Aufgrund zunehmender geografischer Ausdehnung von FSMEV und dessen Vektoren steigt die Zahl erkrankter Personen stetig. Dennoch gibt es bis heute keine spezifische, antivirale Behandlung. Das Ziel diese Dissertation war daher zu dem Verständnis der zellulären Prozesse während einer FSMEV-Infektion beizutragen.

Das Genom der Flaviviren ist ein einzelsträngiges RNA Molekül mit einer positiven Strangorientierung, das ein einzelnes offenes Leseraster kodiert, welches aus zehn viralen Genen besteht. Die drei Strukturproteine und sieben nicht-strukturelle Proteine werden als ein einziges Polyprotein exprimiert, welches co- und posttranslational durch virale und zelluläre Proteasen gespalten wird. Diese Form der Proteinexpression behindert die Untersuchung einzelner FSMEV Proteine. Um die Verteilung, Funktion und molekularen Interaktionen jedes viralen Proteins im Rahmen dieser Doktorarbeit einzeln zu untersuchen, wurden alle FSMEV Gene kloniert und einzeln exprimiert. Molekulare Interaktionsstudien zeigten sowohl die Bildung zahlreicher Dimere und Oligomere als auch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen viralen Proteinen. Schließlich wurden die rekombinanten TBEV-Proteine verwendet, um mittels Massenspektrometrie ein vollständiges Wirts-Interaktom aller TBEV-Proteine zu erzeugen.

In infizierten Zellen nutzen Flaviviren die Wirtszelle für ihre eigene Replikation und erzeugen dabei zelluläre Stressreaktionen wie z.B. die ungefaltete Protein-Antwort. Der IRE1 Signalweg erhöht die Proteinfaltungskapazität sowie die Lipidsynthese. Daher wurde spekuliert, dass dieser Signalweg die Replikation von Flaviviren unterstützt. Um zu untersuchen welche Rolle die ungefaltete Protein-Antwort in der FSMEV Infektion spielt, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit humane astrozytäre, neuronale und intestinale Zelllinien mit den FSMEV Stämmen Neudörfl und HB171 sowie dem Langat Virus (LGTV) infiziert. Die Virusreplikation in den verschiedenen Zelllinien spiegelte den natürlich beobachteten Tropismus der untersuchten Virusstämme wider. Darüber hinaus aktivierten alle drei Virusstämme den IRE1 Signalweg. Interessanterweise wurden hierbei stammspezifische Unterschiede beobachtet. Abschließend wurde untersucht welchen Einfluss der IRE1 Signalweg auf die Replikation von FSMEV hat. Sowohl eine Hemmung der Kinase als auch der RNase Aktivität resultierte in eine signifikant reduzierte Virusreplikation in Astrozyten. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse eine mögliche Rolle der ungefalteten Protein-Antwort in Astrozyten für die Neuropathologie der FSME nahe.

Im ZNS infizieren neurotrope Flaviviren wie FSMEV verschiedene hirnresidente Zelltypen wie Mikroglia oder Astrozyten, die an der Immunantwort beteiligt sind und die Ausbreitung von Viren einschränken. Bei einer FSMEV Infektion, erkennen RLR Rezeptoren das virale Genom und induzieren eine frühe Interferonantwort, indem sie mittels des Adaptermoleküls MAVS die Information in den Nukleus weiterleiten. Im Rahmen dieser Dissertation sollten die Zelltypen im ZNS identifiziert werden, die maßgeblich an der IFN-β Produktion während einer FSME Infektion beteiligt sind. Hierfür wurden murine Neuronen, Astrozyten und Mikroglia isoliert und in vitro mit FSMEV infiziert. Wir konnten zeigen, dass Astrozyten die Hauptproduzenten von IFN-β unter den ZNS Zellen sind. Ferner haben wir entdeckt, dass die IFN-β Antwort in Astrozyten in zwei Phasen verläuft, wobei die frühe Immunantwort MAVS-abhängig ist und die späte Phase auf MyD88 und TRIF beruht.

Zusammenfasend ergaben die in dieser Arbeit generierten Ergebnisse, neue Wirtsfaktoren und zelluläre Prozesse, die direkt mit einzelnen TBEV-Proteinen interagieren. Darüber hinaus stellen zelluläre Signalwege, wie die der ungefalteten Protein- und IFN-Antworten, potenzielle Angriffspunkte für therapeutische Interventionen dar. Ein besseres Verständnis der komplexen Rollen dieser Signalwege im spezialisierten Milieu des ZNS ist erforderlich, um den therapeutischen Bedarf bei neurotropen Flavivirus-Infektionen zu decken.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export