Host cell responses and protein-protein interactions in tick-borne encephalitis virus infection

Durch Zecken übertragene Flaviviren der Familie Flaviviridae werden entweder durch Zeckenstiche oder den Verzehr von Rohmilchprodukten von infizierten Wiederkäuern übertragen. In schweren Infektionsverläufen gelangen die Viren in das zentrale Nervensystem (ZNS), wo sie eine Entzündung des Gehirns und neurologische Komplikationen wie Enzephalitis, Meningitis oder Meningoenzephalitis hervorrufen können. Für unterschiedliche Virusstämme wurden Unterschiede im Gewebetropismus und in der Pathogenität beschrieben.  Das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV) ist das am häufigsten durch Zecken übertragene Virus in Europa und Asien. Aufgrund zunehmender geografischer Ausdehnung von FSMEV und dessen Vektoren steigt die Zahl erkrankter Personen stetig. Dennoch gibt es bis heute keine spezifische, antivirale Behandlung. Das Ziel diese Dissertation war daher zu dem Verständnis der zellulären Prozesse während einer FSMEV-Infektion beizutragen.

Das Genom der Flaviviren ist ein einzelsträngiges RNA Molekül mit einer positiven Strangorientierung, das ein einzelnes offenes Leseraster kodiert, welches aus zehn viralen Genen besteht. Die drei Strukturproteine und sieben nicht-strukturelle Proteine werden als ein einziges Polyprotein exprimiert, welches co- und posttranslational durch virale und zelluläre Proteasen gespalten wird. Diese Form der Proteinexpression behindert die Untersuchung einzelner FSMEV Proteine. Um die Verteilung, Funktion und molekularen Interaktionen jedes viralen Proteins im Rahmen dieser Doktorarbeit einzeln zu untersuchen, wurden alle FSMEV Gene kloniert und einzeln exprimiert. Molekulare Interaktionsstudien zeigten sowohl die Bildung zahlreicher Dimere und Oligomere als auch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen viralen Proteinen. Schließlich wurden die rekombinanten TBEV-Proteine verwendet, um mittels Massenspektrometrie ein vollständiges Wirts-Interaktom aller TBEV-Proteine zu erzeugen.

In infizierten Zellen nutzen Flaviviren die Wirtszelle für ihre eigene Replikation und erzeugen dabei zelluläre Stressreaktionen wie z.B. die ungefaltete Protein-Antwort. Der IRE1 Signalweg erhöht die Proteinfaltungskapazität sowie die Lipidsynthese. Daher wurde spekuliert, dass dieser Signalweg die Replikation von Flaviviren unterstützt. Um zu untersuchen welche Rolle die ungefaltete Protein-Antwort in der FSMEV Infektion spielt, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit humane astrozytäre, neuronale und intestinale Zelllinien mit den FSMEV Stämmen Neudörfl und HB171 sowie dem Langat Virus (LGTV) infiziert. Die Virusreplikation in den verschiedenen Zelllinien spiegelte den natürlich beobachteten Tropismus der untersuchten Virusstämme wider. Darüber hinaus aktivierten alle drei Virusstämme den IRE1 Signalweg. Interessanterweise wurden hierbei stammspezifische Unterschiede beobachtet. Abschließend wurde untersucht welchen Einfluss der IRE1 Signalweg auf die Replikation von FSMEV hat. Sowohl eine Hemmung der Kinase als auch der RNase Aktivität resultierte in eine signifikant reduzierte Virusreplikation in Astrozyten. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse eine mögliche Rolle der ungefalteten Protein-Antwort in Astrozyten für die Neuropathologie der FSME nahe.

Im ZNS infizieren neurotrope Flaviviren wie FSMEV verschiedene hirnresidente Zelltypen wie Mikroglia oder Astrozyten, die an der Immunantwort beteiligt sind und die Ausbreitung von Viren einschränken. Bei einer FSMEV Infektion, erkennen RLR Rezeptoren das virale Genom und induzieren eine frühe Interferonantwort, indem sie mittels des Adaptermoleküls MAVS die Information in den Nukleus weiterleiten. Im Rahmen dieser Dissertation sollten die Zelltypen im ZNS identifiziert werden, die maßgeblich an der IFN-β Produktion während einer FSME Infektion beteiligt sind. Hierfür wurden murine Neuronen, Astrozyten und Mikroglia isoliert und in vitro mit FSMEV infiziert. Wir konnten zeigen, dass Astrozyten die Hauptproduzenten von IFN-β unter den ZNS Zellen sind. Ferner haben wir entdeckt, dass die IFN-β Antwort in Astrozyten in zwei Phasen verläuft, wobei die frühe Immunantwort MAVS-abhängig ist und die späte Phase auf MyD88 und TRIF beruht.

Zusammenfasend ergaben die in dieser Arbeit generierten Ergebnisse, neue Wirtsfaktoren und zelluläre Prozesse, die direkt mit einzelnen TBEV-Proteinen interagieren. Darüber hinaus stellen zelluläre Signalwege, wie die der ungefalteten Protein- und IFN-Antworten, potenzielle Angriffspunkte für therapeutische Interventionen dar. Ein besseres Verständnis der komplexen Rollen dieser Signalwege im spezialisierten Milieu des ZNS ist erforderlich, um den therapeutischen Bedarf bei neurotropen Flavivirus-Infektionen zu decken.