Untersuchungen zur Expression und Funktion von Toll-like Rezeptoren an isolierten kaninen Enterozyten und zur immunhistologischen Phänotypisierung epithelialer Stammzellen im normalen Darm sowie in intestinalen Adenomen und Karzinomen des Hundes
Die Darmschleimhaut stellt die Barriere zwischen dem Inhalt des Darmlumens und dem Wirt dar. Daher steht sie in ständigem Kontakt mit diversen luminalen Antigenen. Zur Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase haben sich verschiedene Mechanismen entwickelt, um die Integrität der physikalischen Barriere zu bewahren und angemessene Immunantworten auf Kommensalen und Pathogene zu generieren. Intestinale Epithelzellen (IECs) stellen zum einen die physikalische Grenze zwischen dem Darmlumen und dem Wirt dar, zum anderen sind sie auch an immunologischen Abwehrprozessen beteiligt. IECs detektieren Pathogen-assoziierte molekulare Muster über verschiedene Mustererkennungsrezeptoren, wie z.B. Toll-like Rezeptoren (TLRs). Eine Dysregulation der TLR-Expression wird im Zusammenhang mit verschiedenen intestinalen Krankheiten bei Menschen, Mäusen und Hunden beschrieben. Um weitere Einblicke in die Verteilung und das Expressionsniveau von TLRs im Hundedarm zu erhalten, wurde in dieser Arbeit die Expression von TLR2, TLR3, TLR4, TLR5 und TLR9 von isolierten kaninen IECs unter homöostatischen Bedingungen und nach Stimulation mit TLR-Liganden in vitro untersucht. Isolierte kanine IECs exprimierten überwiegend TLR5 und TLR9 und in geringerem Maße TLR2, TLR4 und TLR3. Die Stimulation mit TLR-Liganden hatte keinen Einfluss auf die TLR-Expression in vitro.
Die Darmschleimhaut regeneriert sich kontinuierlich während der Homöostase und als Reaktion auf epitheliale Schäden. Als Ursprungszelle für die IECs dienen intestinale epitheliale Stammzellen (IESCs), die sich an der Kryptbasis befinden. IESCs sind in der Lage, sich in die verschiedenen, sekretorischen und absorptiven intestinalen Epithelzelllinien zu differenzieren. Darüber hinaus können IESCs als Reaktion auf dysregulierte Signalkaskaden, z.B. den Wnt-Signalweg, als Tumorstammzellen dienen. Die durchgeführten immunhistochemischen Untersuchungen am normalen kaninen Darm unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für epitheliale intestinale Stammzellmarker (Homeodomain-only protein X(Hopx), Sex determining region Y box-containing Transkriptionsfaktor 9 (Sox9), doublecortin-like kinase 1 (DCLK1), Survivin) haben gezeigt, dass die IESCs, ähnlich wie bei Menschen, Mäusen, Schweinen und Pferden, auch beim Hund in den tiefen Krypten lokalisiert sind. Darüber hinaus wurde im kaninen Dünndarm eine Immunreaktion gegen DCLK1 in einzelnen Zellen entlang der Krypt-Villus-Achse festgestellt. DCLK1 ist ein Marker für intestinale Büschelzellen (tuft cells) und ein potentieller Marker für Tumorstammzellen. Aufgrund der Koexpression von Sox9 sowie β-Tubulin und Zytokeratin 18 wurden die Sox9+/DCLK1+ Zellen als Büschelzellen identifiziert. Im normalen kaninen Dickdarm wurden nur sehr wenige Büschelzellen in den Krypten nachgewiesen. Insbesondere aufgrund genetischer Übereinstimmungen zwischen Mensch und Hund im adenomatous polyposis coli (APC)-Gen werden die spontan auftretenden Darmtumoren des Hundes als natürliches Modell für menschlichen Darmkrebs diskutiert. Mutationen in diesem Tumorsuppressorgen werden bereits in einem frühen Stadium der Tumorentstehung beobachtet und spielen daher eine wichtige Rolle bei der Erforschung der intestinalen Karzinogenese. In dieser Arbeit wurde die Expression der intestinalen epithelialen Stammzellmarker Sox9, Hopx und Survivin sowie des Büschelzellmarkers DCLK1 in intestinalen Karzinomen sowie kolorektalen Adenomen und Adenokarzinomen des Hundes untersucht. Ähnlich wie beim Menschen, waren die angewandten Marker in allen untersuchten Neoplasien verstärkt exprimiert. Es wurden jedoch keine relevanten Unterschiede zwischen Tumoren unterschiedlicher Dignität oder zwischen verschiedenen Stadien der Invasion festgestellt. Sox9, welches im normalen kaninen Darm insbesondere in den Krypten und Einzelzellen entlang der Krypt-Villus-Achse exprimiert wurde, war in allen untersuchten Tumoren vermehrt nachweisbar. Die höchste Immunreaktivität stellte sich hierbei in kolorektalen Adenomen dar, gefolgt von den kolorektalen Adenokarzinomen und den Adenokarzinomen des Dünndarms. Hopx wurde in Einzelzellen des normalen Dünn- und Dickdarms in der Kryptbasis exprimiert. Die Immunreaktivität der intestinalen Neoplasien variierte stark in allen drei Gruppen. Generell wies ein höherer Prozentsatz der kolorektalen Adenome im Vergleich zu den Adenokarzinomen geringere kombinierte Scores auf. DCLK1, welches die Büschelzellen im normalen kaninen Darm markiert, wies eine diffuse und granuläre Immunreaktivität in intestinalen Neoplasien auf. Hierbei zeigte ein größerer Anteil der malignen Tumoren im Vergleich zu den gutartigen Tumoren einen geringeren kombinierten Score im Vergleich zu den gutartigen Tumoren. Survivin wurde überwiegend in der Kryptbasis des normalen Hundedarms nachgewiesen und wurde multifokal in den untersuchten Neoplasien exprimiert. Die Immunreaktivität der untersuchten intestinalen Tumore wies dabei jedoch keine erkennbaren Unterschiede zwischen den gutartigen und bösartigen Subtypen auf.
The intestinal mucosa represents the barrier between the luminal content and the host species. Therefore, it is in steady contact with abundant luminal antigens. To maintain intestinal homeostasis various mechanisms have evolved to preserve the integrity of the physical barrier and to orchestrate appropriate immune responses to commensals and pathogens. Intestinal epithelial cells (IECs) do not represent the physical interface between lumen and host, but take part in immunological processes by recognizing pathogen-associated molecular patterns via Toll-like receptors (TLRs). Dysregulation of TLR expression is known to contribute to various intestinal entities in humans, mice and dogs. To reveal further insights into the distribution and expression level of TLRs in canine gut, we investigated the expression of TLR2, TLR3, TLR4, TLR5 and TLR9 by primary canine IECs under steady state conditions and after stimulation with TLR ligands in vitro. Primary canine IECs predominantly expressed TLR5 and TLR9 and to a lesser extent TLR2, TLR4 and TLR3. However, stimulation with TLR ligands did not change the TLR expression pattern in vitro.
At steady state and in response to epithelial injury, the intestinal mucosa is rapidly regenerating from the intestinal epithelial stem cells (IESCs) that are located at the base of intestinal crypts. IESCs are able to differentiate into the different secretory and absorptive intestinal epithelial cell lines. In addition, IESC can serve as cancer stem cells in response to dysregulated signaling cascades, e.g. Wnt signaling pathway. As reported in humans, mice, pigs and horses, canine IESCs are located in the deep crypts. Furthermore, we detected doublecortin-like kinase 1 (DCLK1) immunoreaction, a marker for intestinal tuft cells and potentially for cancer stem cells, in single cells of normal small intestine along the crypt-villus axis. Due to the coexpression of Sox9, these cells were identified as tuft cells. In canine large intestine, only very low numbers of tuft cells were detected in the crypts. As humans and dogs share genetic similarities, canine intestinal neoplasms are suggested as a natural model for human colorectal cancer. In this study, we analyzed the expression of stem cell markers Sox9, Hopx and survivin as well as tuft cell marker DCLK1 in canine intestinal tumors. These markers showed an increased immunoreactivity in all investigated neoplasms. However, no significant differences were detected neither between tumors of different dignity nor between the various stages of invasion. Sox9, which was expressed in the normal canine intestine particularly in the crypts and single cells along the crypt-villus axis, was increased in all tumors examined. The highest immunoreactivity was found in colorectal adenomas, followed by colorectal adenocarcinomas and adenocarcinomas of the small intestine. Hopx was expressed in single cells of normal small and large intestine at the crypt base. The immunoreactivity of the intestinal neoplasms varied markedly among all three tumor subtypes. In general, a higher percentage of colorectal adenomas had lower combined scores compared with adenocarcinomas. DCLK1, which labels tuft cells in normal canine intestine, exhibited diffuse and granular immunoreactivity in intestinal neoplasms. Here, a higher proportion of malignant tumors showed a lower combined score compared with benign tumors. Survivin was predominantly detected in the crypt base of the normal canine intestine and was expressed multifocally in the neoplasms investigated. However, the immunoreactivity of the intestinal tumors studied showed no obvious differences between the combined scores of benign and malignant subtypes.
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