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Application of Antisense Oligonucleotides and Adenoassociated Virus in a Spinal Muscular Atrophy Model

Die Spinale Muskelatrophie ist eine neurodegenerative Erkrankung, die zu einem Verlust der Motoneurone im Rückenmark und im Hirnstamm führt. Eine Mutation oder Deletion im Survival of motoneuron-Gen 1 verhindert die Produktion des Survival of motoneuron Protein. Das Survival of motoneuron-Gen 2 kann teilweise den Mangel an SMN Protein kompensieren. Da jedoch eine C zu T Transition in diesem Gen vorliegt, werden 90 % des SMN Proteins auf Grund eines inkorrekten Spleißings sofort degradiert. Das seit 2017 zugelassene Medikament Nusinersen, ein Antisense Oligonukleotid (ASO), korrigiert das Spleißing und verlängert damit das Leben der Patienten. Es kann jedoch die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren, daher wirkt es nur im Rückenmark und muss intrathekal verabreicht werden. Dies führt zu der Theorie, dass mehr periphere Organdefekte unter einer ASO Behandlung auftreten. Um diese Defekte vorhersagen zu können, haben wir eine Methode etabliert, intrathekale Applikationen an Mäusen zum Postnataltag 1 unter Cryoanästhesie durchzuführen. Neben dem SMN Mangel treten noch weitere Veränderungen auf Proteinebene auf. Die Signalproteine B-RAF und 14-3-3 sind herunter reguliert, während AKT und ERK hyper-phosphoryliert sind. Es wird vermutet, dass eine Korrektur diese Signalwege ebenfalls, wie bei der Restauration der SMN Proteinmenge, einen positiven Effekt auf die Patienten hat. In SMA und heterozygoten embryonalen Motoneuronen haben wir B-RAF und 14-3-3 mit selbstproduzierten AAVs überexprimiert. Als Kontrolle diente ein AAV, der tdTomato exprimiert. Bei einer kombinatorischen Transduktion der Zellen mit dem AAV-B-RAF und dem AAV-14-3-3 im Vergleich zu der Transduktion mit dem AAV-tdTomato konnte ein deutlicher Anstieg in den phospho-ERK Leveln der heterozygoten Kontrollzellen beobachtet werden, der bei den SMA Zellen nicht vorhanden war. Das könnte damit zusammenhängen, dass ERK bei der SMA bereits hyper-phosphoryliert ist.

Spinal muscular atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease primarily affecting the motoneurons in the brain stem and the spinal cord. Due to a deletion or mutation in the survival of motoneuron gene 1 (SMN1) the survival of motoneuron (SMN) protein is no longer produced. The survival of motoneuron gene 2 (SMN2) can partially compensate the loss. Though, due to a crucial C to T transition only 10 % of the protein is correctly spliced and functional. The SMN2 copy number strongly influences the clinics of patients, which differs from very severe types with early death to milder types with a slower disease progression. In 2017, the first drug for SMA was approved. An antisense oligonucleotide 10-27 namely Nusinersen corrects the splicing of the SMN2 transcript leading to the production of more full length SMN. Due to the inability to cross the blood-brain-barrier intrathecal administration of Nusinersen is needed. It corrects splicing only in the spinal cord, not in the peripheral organs. Since patients survive with a treatment, increasing peripheral organ defects are expected. To predict those defects, we established a method of intrathecal injection under cryoanesthesia in mice on postnatal day 1. Besides the SMN-dependent processes, other SMN-independent signaling pathways are altered in SMA. A combinatorial treatment correcting those pathways additional to SMN level restauration may be beneficial in SMA therapy. For instance, AKT and ERK are hyper-phosphorylated in SMA whereas B-RAF and 14-3-3 ζ/δ are downregulated. To enhance B-RAF and 14-3-3 ζ/δ levels in affected murine primary embryonic cells in vitro, an AAV2-B-RAF and an AAV-14-3-3-ζ/δ were produced and used for experiments. Control cells were transduced with an AAV-dTomato construct. A significant difference between cells expressing B-RAF and 14-3-3-ζ/δ compared to dTomato expressing cells were observed between genotypes in p-ERK levels. This implies an already existent hyper-activation of ERK in SMA mice.

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