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Der Einfluss des Kollagen-bindenden Integrins α2/β1 auf die Entstehung von heterotopen Ossifikationen in der murinen Sehne

Problemstellung: Die Achillessehnenruptur gehört zum Alltag in der unfallchirurgischen Patienten­versorgung und sowohl die konservative als auch die operative Therapie sind mit langen Rehabilitations- und Ausfallzeiten für die Patienten verbunden. Eine häufige post­opera­tive Kom­pli­kation nach Achillessehnenoperation mit einer Inzidenz von 14-28% stellen hetero­tope Ossifikationen (HO) der Sehne da, wobei die dafür verant­wort­lichen pathophysiolo­gischen Entstehungs­mecha­nismen noch weitgehend unklar sind. Nach wie vor unerforscht ist die Rolle des wichtigsten Kollagen I Rezeptors Integrin α2/β1 auf die Entstehung von HO in der Sehne. Das Transmembranmolekül Integrin α2/β1 gilt als wichtigster Rezeptor für fibrilläres Kollagen I, welches Hauptbestandteil der ECM sowohl in der Sehne als auch im Knochen ist. Vorarbeiten haben bereits in der nativen Sehne und Knochen Ver­än­derungen bei der ITGA2 -/- Maus feststellen können, so weist die Sehne schmalere Kollagenfibrillen auf und der native Knochen enthält mehr Kollagen I, hat eine abweichende Fi­bril­len­­morphologie sowie einen höheren Anteil von trabekulärem Knochen. Anhand dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass das Fehlen von Integrin α2/β1 auch einen Einfluss auf die Entstehung von HO in der Sehne hat.     

Methodik: Es wurde bei 8 bis 14 Wochen alten männlichen Mäusen (WT vs. ITGA 2 -/-) eine experimentelle Tenotomie der Achillessehne durchgeführt mit anschließender Readaptation der Sehnenstümpfe durch eine 2-fache Kernnaht modif. nach Lange. Zur Fixierung des Sprung­gelenkes wird eine Fadencerclage angelegt, sodass eine maximale Dorsalextension von 30° erreicht werden kann. Zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 2, 4, 6, 16 Wochen) werden die Tiere getötet und die Sehnen werden mithilfe µ-CT, Histologie und Immunhistochemie vergleichend untersucht.          
Ergebnisse: Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Operationsmodell zeigt verlässlich und reproduzierbar die Entstehung von HO in der murinen Achillessehne bereits vier Wochen post OP unter kliniknahen Bedingungen. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass das Fehlen von Integrin α2/β1 einen Einfluss auf die Entstehung von HO in der murinen Achillessehne hat. So führt der Integrin α2/β1 knockout zu hoch signifikant mehr HO in der Achillessehne bei nicht operierten 24 Wochen alten Tieren. Nach operativer Tenotomie führt das Fehlen von Integrin α2/β1 zu signifikant mehr Knorpel (Kollagen II positiven Zellen) in der frühen Heilungsphase. Anhand der Ergebnisse der immunhistoche­mi­schen Färbungen konnte gezeigt werden, dass sich diese Kollagen II positiven Chondrozyten auch früher und im höheren Ausmaß zu hyper­trophen Kollagen X positiven Zellen differenzieren, was letztlich in einem höheren Knochenvolumen der HO resultiert.
Ausblick: Die vorliegende Untersuchung zeigt, dass Integrin α2/β1 einen Einfluss auf die Entstehung von HO in der Sehne hat. Es kann keine mechanistische Erklärung für den veränderten Kollagen II und X Gehalt der Knorpelanlagen der ITGA 2-/- Maus geliefert werden, der im Zuge der enchondralen Ossifikation entsteht. Die Ergebnisse können allerdings als Grundlage für weitere Experimente auf zellulärer Ebene dienen. Folgeuntersuchungen konnten bereits eine Aktivierung des BMP-Signalweges durch den Integrin α2/β1 knockout nachweisen, dies ist Gegenstand aktueller weiterer Untersuchungen. Letztlich kann die ITGA2 -/- Maus als transgenes Modelltier für die Erforschung von HO dienen, um die pathophysiologischen Prozesse weiter zu erforschen.

Research question: The Achilles tendon rupture is a frequent occurrence and belongs to the daily routine in trauma surgery. Both conservative and surgical therapy are joined with long rehabilitation and downtime for patients. A common postoperative complication after Achilles tendon surgery, with an incidence of 14-28%, is the development of heterotopic ossification (HO) in tendon, although the pathophysiological mechanisms leading to this bone formation remain largely unexplored. Still unknown is the role of the major collagen I receptor integrin α2/β1 on the development of HO in tendon. The transmembrane molecule integrin α2/β1 is regarded as the major receptor for fibrillar collagen I, which is the main component of the extracellular matrix of tendon and bone. Previous studies have already demonstrated differences in native tendons and bone of the ITGA2-/- mice. Their tendons consist of smaller collagen fibrils and the bone contains more collagen I, has an altered fibril morphology and a higher proportion of trabecular bone. Based on these findings, it is hypothesized that the absence of integrin α2/β1 affects the development of HO in tendon.        

Methods: An experimental full thickness tenotomy of the Achilles tendon was performed in 8 to 14 weeks old male mice (WT vs. ITGA2-/-) with a following readaptation of the stumps by a 2-fold core suture in a modified Lange technique. The ankle joint is fixed by a suture cerclage allowing a maximal dorsal extension of 30° of the joint. At different points in time (1,3,4,6,16 weeks) the animals are euthanized and the tendons are examined using µ-CT, histology and immunohistochemistry.        
Results: The microsurgical operation model shows, reliable and reproduceable, the formation of HO in the murine Achilles tendon beginning four weeks post-op under near clinical conditions. For the first time it could be demonstrated that the absence of integrin α2/β1 has an effect on the development of HO in the murine Achilles tendon. The integrin α2/β1 knockout leads to highly significantly more HO in the Achilles tendon in 24 weeks old animals. And after a full transection tenotomy, the absence of integrin α2/β1 leads to significantly more cartilage (collagen-II-positive cells) in the early healing phase. From the results of the immunohistochemical staining, it could be demonstrated that these collagen II positive chondrocytes differentiate earlier and to a higher extent into hypertrophic collagen X positive cells, which finally results in a higher bone volume of the HO.        
Prospect: The present study shows evidence that integrin α2/β1 has an influence on the development of HO in tendon. Yet no mechanistic explanation can be provided for the changes in collagen II and X content of the cartilage from the ITGA2-/- mice during endochondral ossification. Nevertheless, the findings can be used as a basis for further cell-based experiments. Follow-up studies could already demonstrate an activation of the BMP-signaling pathway by the integrin α2/β1 knockout, this will be the subject of further studies. However, the ITGA2-/- mouse may serve as a transgenic animal model for further research of the still unknown pathophysiological processes leading to HO.

 

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