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Rolle des Komplementsystems in einem Schweineretina Organkulturmodell

Die Heilung des Glaukoms, der zweithäufigste Erblindungsursache weltweit, ist zum heutigen Zeitpunkt nicht möglich. Im Verlauf der Erkrankung kommt es durch Untergang retinaler Ganglienzellen und derer Axone zu progressiven Gesichtsfeldausfällen. Da die bei betroffenen Patienten bisher durchgeführte Augeninnendrucksenkung alleine in einigen Fällen nicht ausreicht, um die mit der Erkrankung einhergehende Neurodegeneration vollständig aufzuhalten, ist es nötig neue Therapieansätze zu erforschen. Das Komplementsystem als Teil des angeborenen Immunsystems wird zunehmend mit der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen, wie dem Glaukom, in Verbindung gebracht. So konnten bereits erhöhte Spiegel von Komplementproteinen in Seren und Retinae von Patienten mit primärem Offenwinkelglaukom nachgewiesen werden. Ziel dieser Studie war es, die Rolle des Komplementsystems in der Krankheitsentstehung genauer zu untersuchen, um künftig auf dieser Ebene in der Glaukompathogenese eingreifen zu können. Nachgewiesenermaßen spielen oxidativer Stress und Hypoxie in der Frühphase der Glaukompathogenese eine entscheidende Rolle, sodass die Induktion dieser Prozesse im Gewebe eine Neurodegeneration auslöst, die geeignet ist eine Beteiligung der Komplementkaskade bei der Neurodegeneration der Retina genauer zu untersuchen. Für die vorliegende Arbeit wurden Schweineaugen vom lokalen Schlachthof bezogen, da das Schweineauge im Vergleich zu dem des Nagetieres eine bessere Übereinstimmung mit dem menschlichen Auge besitzt. Die aus den Augen explantierten Schweineretinae wurden über einen Zeitraum von zwei und vier Tagen kultiviert. Durch Zugabe von H2O2 an Tag eins wurde oxidativer Stress (HE, IHC: n=8/Gruppe/Zeitpunkt; RT-qPCR: n=4/Gruppe/Zeitpunkt) ausgelöst und mithilfe von CoCl2 wurde Hypoxie (HE, IHC: n=8/Gruppe/Zeitpunkt; RT-qPCR: n=4/Gruppe/Zeitpunkt) induziert. Eine unbehandelte Gruppe diente als Kontrolle (HE, IHC: n=8/Gruppe/Zeitpunkt; RT-qPCR: n=4/Gruppe/Zeitpunkt). Hierzu wurden im Anschluss an die Kultivierung immunhistochemische Untersuchungen für verschiedene Komplementmarker (C3, C5, C1q, Faktor B, MASP2) und Mikroglia (Iba1) durchgeführt. Ergänzend dazu wurden Synapsen mittels PSD95 und VGLUT1 immunhistochemisch untersucht und RT-qPCR-Analysen zu verschiedenen Komplementkomponenten (C1QA, C1QB, C1QC, C5, CFB, MASP2) auf mRNA Ebene durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass das Komplementsystem in dem vorgelegten Modell der Hypoxie aktiviert ist. Es wurden eine höhere Anzahl C3+-Zellen nach zwei Tagen (p=0,021), sowie mehr MAC+-Zellen nach vier Tagen (p=0,04) in der CoCl2-Gruppe nachgewiesen. Bei der Untersuchung der Kolokalisation von Mikroglia und C1q zeigten sich vermehrt C1q+-Mikroglia in der CoCl2-Gruppe nach vier Tagen (p=0,027). Mithilfe der RT-qPCR-Analysen konnte eine gesteigerte mRNA Expression von C1QA in der H2O2-Gruppe nach zwei Tagen nachgewiesen werden (p=0,028). Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass anhand der durchgeführten Untersuchungen eine erhöhte Aktivität des Komplementsystems im verwendeten Organkulturmodell bei durch Hypoxie gestressten Retinae beobachtet werden konnte. 

The cure of glaucoma, the second most common cause of blindness worldwide, is not possible at the present time. In the course of the disease, the loss of retinal ganglion cells and their axons lead to progressive visual field deficits. Since the lowering of the intraocular pressure, which is carried out in affected patients, is in some cases insufficient to completely stop the neurodegeneration associated with the disease, it is necessary to research new therapeutic approaches. The complement system as part of the innate immune system is increasingly associated with the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as glaucoma. Increased levels of complement proteins have already been demonstrated in the sera and retinas of patients with primary open-angle glaucoma. The aim of this study was to examine the role of the complement system in the development of the disease in order to be able to intervene in glaucoma pathogenesis at this level in the future. It has been proven that oxidative stress and hypoxia play a decisive role in the early phase of glaucoma pathogenesis, so that the induction of these processes triggers neurodegeneration in the tissue, which is suitable for investigating the involvement of the complement cascade in neurodegeneration of the retina in more detail. For the present work, pig eyes were obtained from the local slaughterhouse, since the pig's eye corresponds better to the human eye than that of the rodent. The pig retinae explanted from the eyes were cultured over a period of two and four days. By adding H2O2 on day one, oxidative stress (HE, IHC: n=8/group/time point; RT-qPCR: n=4/group/time point) was triggered and with the help of CoCl2 hypoxia (HE, IHC: n=8/group/time point; RT-qPCR: n=4/group/time point) was induced. An untreated group served as a control (HE, IHC: n=8/group/time point; RT-qPCR: n=4/group/time point). For this purpose, immunohistochemical examinations for various complement markers (C3, C5, C1q, factor B, MASP2) and microglia (Iba1) were carried out after the cultivation. In addition, synapses were examined immunohistochemically using PSD95 and VGLUT1 and RT-qPCR analyzes were carried out on various complement components (C1QA, C1QB, C1QC, C5, CFB, MASP2) at the mRNA level. It could be shown that the complement system is activated in the presented model of hypoxia. A higher number of C3 positive cells were detected after two days (p=0.021) and also more MAC positive cells after four days (p=0.04) in the CoCl2 group. The investigation of the colocalization of microglia and C1q showed an increased number of C1q positive microglia in the CoCl2 group after four days (p=0.027). With the help of the RT-qPCR analyzes, an increased mRNA expression of C1QA could be detected in the H2O2 group after two days (p=0.028). In conclusion, it can be said that, on the basis of the investigations carried out, an increased activity of the complement system in retinas stressed by hypoxia could be observed in the organ culture model used. 

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