The cell division protein MapZ, the putative tryptophan substrate-binding protein TrpA, and the pore-forming toxin suilysin : Characterization of three fitness- and virulence-associated factors of Streptococcus suis
Streptococcus suis is a facultative pathogenic bacterium that colonizes the porcine upper respiratory tract as a commensal or causes invasive infections. Symptoms include sepsis, meningitis, endocarditis, pneumonia as well as arthritis. Importantly, similar pathologies are reported in human S. suis infections. A prevalence of almost 100% in pig farms worldwide demonstrates the effective adaptation of this pathogen to its natural host. During colonization and invasion, S. suis encounters changing environmental conditions. Therefore, S. suis possesses various fitness- and virulence-associated factors contributing to its heterogenous lifestyle. This study aimed at characterizing three of these factors in more detail. These are the mid-cell anchored protein Z (MapZ) and the putative tryptophan-substrate-binding protein TrpA, both are essential for S. suis fitness, as well as the pore-forming toxin suilysin (SLY), a well-known virulence-associated factor. A previous study identified MapZ and TrpA to be conditionally essential for survival in the host using an intrathecal experimental infection of pigs with a transposon library of S. suis strain 10. The first chapter (I) of this thesis describes the investigations on the role of MapZ in the cell division process of S. suis. Accurate placement of the division machinery is a prerequisite for the generation of daughter cells and, therefore, for successful survival in the host. Depletion of MapZ in S. suis strain 10 revealed a growth defect as compared to the wild type. Besides, electron microscopy analysis demonstrated morphological growth defects of the MapZ-deficient mutant, including an irregular cell shape and size as well as mispositioned division septa. Light microscopy and subsequent quantitative image analysis confirmed these morphological alterations. In summary, the results indicated that MapZ is involved in septum positioning during cell division in S. suis as evidenced for other members of the Streptococcaceae family. The second part (II) comprises the characterization of the putative tryptophan substrate-binding protein TrpA. TrpA is part of an ATP-binding cassette (ABC) transporter which is genetically organized as an operon. ABC transporters represent one of the largest transporter classes and play an important role in bacterial survival and virulence. Growth experiments in chemically defined media (CDM) comparing an isogenic TrpA-deficient mutant with the tryptophan-auxotrophic wild-type strain demonstrated that the mutant lacked the capability of high-affinity tryptophan binding and uptake. Bioinformatics analysis revealed that the operon harbors a T‑box riboswitch. Finally, qRT‑PCR and a reporter assay revealed an increase of trpA mRNA as well as promoter activation during growth under tryptophan-limited conditions. Thus, our study provided evidence that TrpA mediates tryptophan transport, and that the operon might be transcriptionally regulated by a T-box riboswitch. The third and last part of this study (III) focused on the pore-forming toxin SLY which plays a crucial role in the pathogenesis of S. suis infections. A high SLY production is associated with cytotoxic effects and the induction of proinflammatory cytokines. Therefore, the role of SLY during the inflammation process following S. suis infection was analyzed in an ex vivo porcine precision-cut lung slice (PCLS) model. Western blot analysis, ELISA, and immunofluorescence microscopy revealed an induction of cyclooxygenase-2 (COX-2) and its metabolite prostaglandin E2 (PGE2), two important regulators of inflammation modulation and immune activation, in porcine lung tissue. The strongest COX-2 signal was detected in bronchial fibroblasts. Moreover, the results indicated that the induction of COX-2 was SLY-dependent as its expression was nearly abolished during infection with an SLY-deficient strain. Taken together, the characterized factors MapZ, TrpA and SLY demonstrate the diversity of S. suis factors contributing to bacterial survival and disease establishment in the host. MapZ is responsible for correct cell division and TrpA ensures the essential import of tryptophan in nutrient-limited conditions. Thus, both factors are crucial for biological fitness of S. suis. SLY, in contrast, is not essential for bacterial survival but is involved in virulence and host inflammatory responses to the pathogen. In conclusion, the three factors studied are crucial for the successful adaptation of S. suis to different host niches encountered during the two phases of its lifestyle, colonization and infection.
Streptococcus suis ist ein fakultativ pathogenes Bakterium, welches entweder als Kommensale im oberen porzinen Respirationstrakt vorkommt oder als invasiver Erreger schwere Erkrankungen hervorruft. Zu den typischen Symptomen gehören Sepsis, Meningitis, Endokarditis, Pneumonie sowie Arthritis. Ähnliche Pathologien sind auch für den Menschen beschrieben. Weltweit liegt die Prävalenz in Schweinebetrieben bei fast 100%, welches die effektive Anpassung dieses Erregers an seinen natürlichen Wirt demonstriert. Während der Kolonisierung und der Invasion ist S. suis mit unterschiedlichen Umweltbedingungen konfrontiert. Deswegen verfügt S. suis über verschiedene Fitness- und Virulenz-assoziierte Faktoren, die seinen heterogenen Lebensstil ermöglichen. Drei dieser Faktoren werden in dieser Arbeit näher charakterisiert. Diese umfassen das Zellteilungsprotein MapZ und das putative Tryptophan-Bindungsprotein TrpA, beide essenziell für die Fitness von S. suis, sowie das poren-bildende Toxin Suilysin (SLY), welches einen der bekanntesten Virulenz-assoziierten Faktoren dieses Erregers darstellt. In einer vorherigen Studie wurden MapZ und TrpA als konditionell essenziell für das Überleben im Wirt identifiziert. Hierfür wurde ein intrathekales Infektionsexperiment im Schwein mit einer Transposon-Bibliothek von S. suis Stamm 10 durchgeführt. Das erste Kapitel (I) dieser These beschreibt die Untersuchungen zu der Rolle von MapZ im Zellteilungsprozess von S. suis. Ein akkurates Platzieren der Zellteilungsmaschinerie ist die Voraussetzung für die Generation von Tochterzellen, und somit auch für das Überleben im Wirt. Der Verlust des MapZ-Proteins in S. suis Stamm 10 bewirkte einen Wachstumsdefekt gegenüber dem Wildtyp. Des Weiteren wurden morphologische Wachstumsdefekte der MapZ-defizienten Mutante mittels Elektronenmikroskopie nachgewiesen. Diese umfassten eine irreguläre Zellform und ‑größe sowie fehlerhaft positionierte Teilungssepten. Lichtmikroskopische Aufnahmen und eine anschließende quantitative Bildanalyse bestätigten diese Abweichungen. Zusammenfassend haben diese Ergebnisse gezeigt, dass MapZ eine Rolle bei der Positionierung des Teilungsseptums während der Zellteilung in S. suis spielt, was bereits für andere Mitglieder der Familie Streptococcaceae nachgewiesen wurde. Der zweite Teil dieser Arbeit (II) umfasst die Charakterisierung des putativen Tryptophan- Bindungsproteins TrpA. TrpA ist Teil eines ATP-Bindungskassetten (ABC)-Transporters, welcher genetisch in Form eines Operons organisiert ist. ABC-Transporter repräsentieren eine der größten Transporter-Klassen und spielen eine zentrale Rolle für das bakterielle Überleben und die Virulenz. Mittels Wachstumsversuchen in chemisch definiertem Medium (CDM) wurden eine isogene TrpA-defiziente Mutante mit dem für Tryptophan auxotrophen Wildtyp-Stamm verglichen. Diese Experimente zeigten, dass der Mutante die Fähigkeit für eine hochaffine Bindung von Tryptophan fehlt. Eine bioinformatische Analyse ergab, dass das Operon einen T-Box Riboschalter beinhaltet. Schließlich zeigten die qRT-PCR und ein Reporterversuch eine Erhöhung der trpA mRNA-Expression und der Promotoraktivität während des Wachstums unter Tryptophanlimitierung. Daher belegt diese Studie, dass TrpA den Transport von Tryptophan vermittelt und die Regulation der Transkription durch einen T‑box Riboschalter erfolgen könnte. Der dritte Teil der Arbeit (III) befasst sich mit dem poren-bildenden Toxin SLY, welches eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von S. suis Infektionen spielt. Eine hohe Produktion von SLY wird mit zytotoxischen Effekten sowie der Induktion proinflammatorischer Zytokine verbunden. Daher wurde die Rolle von SLY während des Entzündungsprozesses im Anschluss an eine Infektion mit S. suis in einem ex vivo Modell mit porzinen Präzisionslungenschnitten (PCLS) näher untersucht. Die Analyse mittels Western Blot, ELISA und Immunfluoreszenz ergab eine Induktion der Cyclooxygenase-2 (COX-2) und ihres Metaboliten Prostaglandin E2 (PGE2), zwei wichtigen Regulatoren der Entzündungsreaktion und Aktivierung des Immunsystems, in porzinem Lungengewebe. Das stärkste COX-2 Signal wurde in bronchialen Fibroblasten detektiert. Außerdem zeigte die Studie, dass die Induktion von COX-2 SLY‑abhängig ist, da die COX-2-Expression während einer PCLS-Infektion mit einem SLY‑defizienten Stamm fast vollständig aufgehoben wurde.
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