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Respiratory syncytial virus reverse genetics for identification of molecular determinants of strain specific phenotypic changes

RSV is one of the world leading causes of lower respiratory tract disease in infants and the elderly. Despite its first isolation in 1956, there are currently no licensed vaccines or antiviral therapeutics available, and many basic questions remain unanswered. To date, historical laboratory adapted RSV strains such as RSV-A2 have been primarily used for research studies. However, significant differences between historical strains and recent clinical isolates have been demonstrated. Reverse genetics enable the generation of recombinant viruses with a defined genotype from plasmid DNA as well as expression of one or several viral proteins in in vitro systems. We generated optimized reverse genetics systems based on two recent clinical isolates (one from each subtype (RSV-A-0594 and RSV-B-9671)), including recombinant viruses containing reporter proteins facilitating detection and quantification. Additional recombinant viruses containing single amino acid changes in the Fusion (F) protein, which confer resistance to neutralization by Palivizumab, a monoclonal antibody, which is licensed for passive immunization of high-risk patients, were generated and characterized. Based on the ability of F alone to cause cell-cell fusion upon transient expression in Vero cells, we investigated subtype and strain dependent differences in fusion activity, as well as the influence of Palivizumab escape mutations. We could show marked differences between the fusion induced by the F protein originating from the two clinical isolates in comparison to the F protein cloned from a historical strain, as well as between the subtypes. Our results highlight the importance of characterizing RSV subtype and strain variability in future research, especially in the context of developing new vaccines and antibodies and associated efficacy studies. Our reverse genetics systems will significantly facilitate future basic and translational research.

Das Humane Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) ist eine der Hauptursachen für Atemwegsinfektionen bei Senioren und Kindern unter 5 Jahren. Seit der Isolation von RSV im Jahr 1956 wurden keine antiviralen Medikamente oder Impfstoffe zugelassen und viele grundlegende Fragen bleiben bis heute ungeklärt. In Studien wurden bisher meist historische, laboradaptierte Stämme wie RSV-A2 verwendet. Es wurden große Unterschiede zwischen diesen historischen Stämmen und neuen klinischen Isolaten nachgewiesen. Reverse-Genetik-Systeme ermöglichen die Erzeugung rekombinanter Viren mit einem definierten Genotyp aus Plasmid-DNA, sowie die Expression von einzelnen oder mehreren Virus-Proteinen in Zellkultur. Wir haben optimierte reverse Genetik-Systeme basierend auf zwei aktuellen klinischen Isolaten (jeweils eines pro Subtyp (RSV-A-0594, RSV-B-9671)) generiert. Ergänzend wurden rekombinante Viren erzeugt, welche zusätzlich für Reporterproteine kodieren, was die Verfolgung der Virusausbreitung in Zellkultursystemen erleichtert, sowie solche die Substitutionen von Aminosäuren aufweisen, die eine Neutralisation des Virus mit einem zur Prävention bei Hochrisikopatienten zugelassenen Antikörper verhindern. Basierend auf der Fähigkeit des RSV-Fusionsproteins bei Transfektion in Zellen deren Fusion zu bewirken haben wir untersucht, wie sich die F-Proteine eines historischen Isolates sowie der beiden Subtypen in ihrer Fusionsaktivität unterscheiden und welchen Einfluss Palivizumab-escape Mutationen hierauf haben. Wir konnten signifikante Unterschiede zwischen einem historischen und unseren aktuellen Isolaten sowie unter den Subtypen feststellen. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der RSV-Subtyp- und Stammvariabilität in zukünftigen Studien, insbesondere im Zusammenhang mit der Entwicklung neuer Impfstoffe und Antikörper und damit verbundener Wirksamkeitsstudien. Unsere reverse Genetik Toolbox wird zukünftige grundlegende und translationale Studien maßgeblich erleichtern.

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