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The effect of high dosed tamoxifen applications on Theiler’s murine encephalomyelitis virus induced hippocampal damage and spinal cord demyelination

Tamoxifen gavage is a frequently used tool in experimental setups applying the CreER/LoxP system to influence the gene expression of genetically engineered organisms. Apart from this very specific use, tamoxifen as a selective estrogen receptor modulator (SERM) has tissue dependent pro- and anti-estrogenic effects on various cell types. The present study examined the effect of three high-dose tamoxifen applications, as used in the CreER/LoxP system, on Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV)-induced acute hippocampal damage in genetically modified mice on a C57BL/6 background (B6) and chronic spinal cord demyelination in wild type SJL mice. All mice of the study were infected intracerebrally with TMEV-BeAn and received three doses of 3 mg tamoxifen-in-oil solution via oral gavage.  The applications followed a scheme suitable for induction of the CreER/LoxP system. Tamoxifen gavage application started either at the time point of infection at 0, 2 and 4 days post infection (dpi) in B6 and SJL mice, 5, 7 and 9 dpi (B6), 18, 20 and 22 dpi (SJL) or 38, 40, 42 dpi (SJL). The TMEV-infected control animals did not receive tamoxifen. As expected for the used virus strain, the B6 mice showed no epileptogenic seizures or clinical signs during the study. In contrast, all SJL mice developed progressive motoric deficits in the chronic phase of TMEV infection. Although there were no differences in the clinical course between the respective treatment groups, histopathological results showed that tamoxifen gavage was associated with transiently increased neuronal loss in the hippocampus of B6 mice and increased demyelination of the spinal cord white matter of SJL mice. Respectively, 58% of the B6 mice without tamoxifen treatment showed minor inflammation with an intact pyramidal layer of the cornu ammonis (CA) 14 days after TMEV infection. The other 42% of this group were affected by marked inflammation with neuronal loss in the pyramidal layer of the CA. Regardless of the presence of lesions, none of the mice without tamoxifen treatment showed intra-hippocampal TMEV antigen on day 14. Interestingly, tamoxifen application at day 0, 2 and 4 as well as 5, 7 and 9 after TMEV infection resulted in a marked inflammatory reaction with loss of pyramidal neurons at 14 dpi in 94-100% of the mice, depending on the time point of the gavage application. In addition, 63% of the tamoxifen treated B6 mice still showed intralesional virus antigen at 14 dpi. Surprisingly, tamoxifen had no effect on the virus load or distribution of virus antigen in the CNS of SJL mice, despite causing a shift in the T cell composition in the brain and spinal cord with increased infiltration of CD8+ T cells. In B6 mice, tamoxifen application was associated with increased astrogliosis with raised numbers of reactive astrocytes of the neurotoxic A1 and to a lesser extent neurotrophic A2 phenotype in the hippocampus at 14 dpi, whereas there was no long-lasting effect on the astrocyte phenotype in the spinal cord of SJL mice 85 dpi. Nevertheless, tamoxifen application had a positive effect on the number of oligodendrocytes and oligodendrocyte progenitor cells in the spinal cord of SJL mice, despite increased demyelination at 85 dpi in animals with application at 38, 40 and 42 dpi. The expression of aquaporin 4 water channels was downregulated within inflammatory lesions of the hippocampus in B6 as well as the spinal cord of SJL mice, but not directly affected by tamoxifen. In addition to many reports on neuroprotective properties of tamoxifen, which could not be shown in this study, tamoxifen application at 0, 2 and 4 dpi had a negative impact on adult neurogenesis in the dentate gyrus of B6 mice at 14 dpi. However, this had no long-lasting effect on the prevalence of neuronal loss at 147 dpi, which was with 20% comparably low in the tamoxifen treated mice as the prevalence of 21% in mice without tamoxifen application.

In summary, tamoxifen application during an acute TMEV infection in B6 mice was associated with transiently increased neuronal loss in the hippocampus, increased reactive astrocytosis, decelerated virus clearance and decreased neurogenesis in the dentate gyrus, depending on the time point of application. In SJL mice, tamoxifen gavage application promoted differentiation and proliferation of oligodendrocytes and their progenitors. However, if applied during chronic myelitis at 38, 40 and 42 dpi, tamoxifen gavage was associated with increased demyelination of the spinal cord white matter.

Tamoxifen ist ein häufig verwendeter Wirkstoff um mittels des CreER/LoxP-Systems die Genexpression von genetisch modifizierten Organismen zu beeinflussen. Abgesehen von dieser sehr spezifischen Verwendung, hat Tamoxifen als selektiver Östrogenrezeptor-Modulator (SERM), gewebeabhängig, pro- und anti-östrogene Wirkungen auf verschiedene Zelltypen. Die vorgestellte Studie untersuchte den Effekt von drei hochdosierten Tamoxifen-Anwendungen wie sie im CreER/LoxP-System verwendet werden, auf durch eine Infektion mit dem Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) ausgelöste Entzündung im Hippokampus von gentechnisch modifizierten Mäusen mit einem C57BL/6 (B6) Hintergrund sowie eine chronische Demyelinisierung im Rückenmark von Wildtyp SJL-Mäusen. Alle Mäuse der Studie wurden intrazerebral mit TMEV-BeAn infiziert und erhielten drei Dosen von jeweils 3 mg Tamoxifen in Öl mittels oraler Gavage. Die Applikationen folgten einem Schema das zur Induktion des CreER/LoxP-Systems geeignet wären. Sie begannen entweder am Tag der Infektion, also 0, 2 und 4 Tage nach der Infektion (dpi) in B6- und SJL-Mäusen, 5, 7 und 9 dpi (B6), 18, 20 und 22 dpi (SJL) oder 38, 40 und 42 dpi (SJL). Die Kontrolltiere waren ebenfalls TMEV-infiziert, erhielten jedoch kein Tamoxifen. Wie für den verwendeten Virusstamm erwartet, entwickelten die B6-Mäuse während des Untersuchungszeitraums keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung oder epileptiforme Anfälle. Im Gegensatz dazu zeigten die SJL-Mäuse progressive, motorische Defizite in der chronischen Phase der TMEV-Infektion. Obwohl sich keine Unterschiede im klinischen Verlauf zwischen den behandelten und unbehandelten Gruppen gab, zeigten sich signifikante Unterschiede in der Histopathologie. Die Tamoxifen-Gavage war vorübergehend mit einem erhöhten neuronalen Verlust im Hippokampus von B6-Mäusen verbunden. Ebenfalls zeigte sich eine verstärkte Demyelinisierung in der weißen Substanz des Rückenmarks bei SJL-Mäusen. Ohne Tamoxifenbehandlung zeigten 58% der B6-Mäuse eine geringgradige Entzündungsreaktion mit einem intakten Stratum pyramidale im Cornu ammonis (CA) 14 Tage nach der TMEV-Infektion. Die anderen 42% dieser Gruppe wiesen eine deutliche Entzündungsreaktion mit prominentem Verlust von Pyramidenzellen im CA auf. Unabhängig von den Läsionen war bei keiner der Mäuse ohne Tamoxifenbehandlung nach 14 Tagen noch TMEV-Antigen im Hippokampus nachweisbar.  Interessanterweise führte die Tamoxifen-Gavage am Tag 0, 2 und 4 sowie 5, 7 und 9 nach der TMEV-Infektion zu einer deutlichen Entzündungsreaktion mit Verlust von Pyramidenzellen in 94% beziehungsweise 100% der Tiere 14 dpi, abhängig vom Zeitpunkt der Gavage.  Darüber hinaus wiesen 63% der mit Tamoxifen behandelten B6-Mäuse noch intraläsionales Virusantigen an Tag 14 auf. Überraschend war, dass eine Tamoxifenbehandlung keine Auswirkungen auf die Viruslast oder die Verteilung des Virusantigens im zentralen Nervensystem (ZNS) von SJL-Mäusen hatte, obwohl sich eine Verschiebung der T-Zell-Zusammensetzung mit erhöhter Infiltration von CD8+ T-Zellen in Gehirn und Rückenmark zeigte. In B6-Mäusen war die Tamoxifenbehandlung mit einer verstärkten Astrogliose mit größeren Zahlen reaktiver Astrozyten des neurotoxischen A1- und in geringerem Maße dem neurotrophen A2-Phänotypen im Hippokampus verbunden. Im Rückenmark von SJL-Mäusen zeigte sich hingegen kein langanhaltender Effekt auf den Phänotyp der Astroglia 85 Tage nach der TMEV-Infektion. Dennoch war ein positiver Effekt von Tamoxifen auf die Anzahl der Oligodendrozyten und deren Vorläuferzellen im Rückenmark von SJL-Mäusen nachweisbar. Dieser Effekt schien jedoch nicht ausreichend zu sein um der verstärkten Demyelinisierung bei Tieren mit einer Tamoxifenbehandlung 38, 40 und 42 dpi entgegen zu wirken. Die Expression von Aquaporin-4-Wasserkanälen war innerhalb der entzündlichen Läsionen im Hippokampus von B6- und im Rückenmark von SJL-Mäusen herunterreguliert, jedoch nicht direkt beeinflusst von Tamoxifen.

Zusätzlich zu vielen Berichte über neuroprotektive Eigenschaften von Tamoxifen, die in dieser Studie nicht gezeigt werden konnte, wirkte sich die Tamoxifen-Anwendung 0, 2 und 4 dpi auch negativ auf die Neurogenese im Gyrus dentatus von B6-Mäusen zum Zeitpunkt von 14 dpi aus. Dies hatte jedoch keinen langanhaltenden Effekt auf den neuronalen Verlusts 147 Tage nach der TMEV-Infektion, welche vergleichbar niedrig bei den Mäusen mit (20%) und ohne Tamoxifenbehandlung (21%) war.

Zusammenfassend war die Tamoxifenbehandlung während einer akuten TMEV-Infektion in B6-Mäusen mit einem transient erhöhten neuronalen Verlust im Hippocampus, einer verstärkten reaktiven Astrozytose, einer verlangsamten Viruselimination und einer verringerten Neurogenese im Gyrus dentatus, in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt der Anwendung, assoziiert. In SJL-Mäusen förderte die Tamoxifen-Gavage die Differenzierung und Proliferation von Oligodendrozyten und ihrer Vorläuferzellen. Wurde Tamoxifen jedoch während der chronischen Myelitis an Tag 38, 40 und 42 nach der TMEV-Infektion appliziert, zeigte sich eine verstärkte Demyelinisierung der weißen Substanz im Rückenmark von SJL-Mäusen.

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