Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) als schnelles Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp., Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in Lebensmitteln

Campylobakteriose und Salmonellose stellen die häufigsten lebensmittelassoziierten Zoonose-Erkrankungen in Europa dar. Die frühzeitige Identifizierung der Infektionserreger leistet daher einen wichtigen Beitrag zum präventiven Verbraucherschutz. In dieser Arbeit werden Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)-Assays beschrieben, die eine schnelle Detektion von Salmonella spp. sowie Campylobacter jejuni und coli in Lebensmitteln ermöglichen und aufgrund ihrer robusten Eigenschaften eine Probenanalyse unter eingeschränkten Bedingungen erlauben. Als optimale genomische Zielregion für einen Salmonella-spezifischen LAMP-Assay setzte sich der ttrRSBCA-Locus gegenüber den alternativen Zielregionen invA, bcfD, phoP, gene62181533 und siiA durch. Für C. jejuni und C. coli wurde ein zweistufiges Assay-System mit rplD-Gen-basierter Simultandetektion der Erreger in Lebensmitteln und nachfolgender Speziesdifferenzierung von Isolaten mithilfe eines cdtC- und gyrA-Gen-basierten Duplex-LAMP-Assays etabliert. Die analytische Spezifität der LAMP-Assays ließ sich anhand 174–180 getesteten Isolaten bestätigen, während die analytischen Nachweisgrenzen der Verfahren zwischen 0,5–5 pg DNA oder 1,1–250 KbE pro Reaktionsansatz betrugen. Mittels ttrRSBCA- bzw. rplD-LAMP-Assay war es auch unter dem Einfluss von Zellstressoren und der Anwendung simpler thermischer DNA-Extraktionsverfahren möglich, initiale Salmonella-Kontaminationen von 1 KbE/25 g nach 20-stündiger Anreicherung bzw. initiale C. jejuni- und C. coli-Kontaminationen von 100–1000 KbE/10 g nach 24-stündiger und 10–100 KbE/10 g nach 48-stündiger Inkubation künstlich kontaminierter Lebensmittelproben nachzuweisen. Die Eignung beider Verfahren für ein schnelles Screening von Lebensmittelproben wurde anhand der Untersuchung natürlich kontaminierter Produkte aus dem Einzelhandel und im Falle des ttrRSBCA-LAMP-Assays zusätzlich anhand von Referenzmaterial bestätigt. Der cdtC-gyrA-LAMP-Assay stellte ein geeignetes Instrument zur Bestätigung und Differenzierung gewonnener C. jejuni- und C. coli-Isolate dar.

Salmonellosis and Campylobacteriosis represent the most frequently reported foodborne zoonoses in Europe. Rapid identification of the infectious agents significantly contributes to preventive consumer protection. In this dissertation, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays are described that allow fast detection of Salmonella spp., Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in food and, due to their high robustness, are suitable for sample analysis under restricted conditions. As an optimal genomic target region for Salmonella detection by LAMP, the ttrRSBCA locus prevailed over the alternative target regions invA, bcfD, phoP, gene62181533 and siiA. A two-step LAMP system was established for C. jejuni and C. coli, including rplD gene-based pathogen detection in food as well as an option for species differentiation using cdtC and gyrA gene-based duplex LAMP. Analytical specificity of the LAMP assays was confirmed by testing 174–180 bacterial isolates, while analytical sensitivity ranged from 0.5–5 pg DNA or 1.1–250 CFU per reaction. Investigation of artificially contaminated food samples by ttrRSBCA- and rplD-LAMP enabled detection of initial Salmonella contaminations up to 1 CFU/25 g after 20-h enrichment and initial C. jejuni/C. coli contaminations up to 100–1000 CFU/10 g after 24-h and 10–100 CFU/10 g after 48-h enrichment, even under the influence of cell stressors and the use of simple thermal DNA extraction procedures. The suitability of both assays regarding rapid food sample screening was confirmed by testing naturally contaminated products from retail and, in the case of the ttrRSBCA-LAMP assay, additionally by reference material. Furthermore, the cdtC-gyrA-LAMP assay provided an appropriate tool for confirmation and differentiation of C. jejuni and C. coli isolates.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:

Export