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Analyse der Interaktion des Tumorsuppressors VHL mit RAPTOR, der zentralen regulatorischen Untereinheit des mTORC1 Komplex

Der Entstehung klarzelliger Nierenzellkarzinome liegen Mutationen im von Hippel Lindau (VHL) -Gen zu Grunde. VHL ist ein Tumorsuppressor, welcher eine wichtige Aufgabe in der Regulierung des HIF-Signalwegs einnimmt, diesen inhibiert und somit der Tumorinitiation und -progression entgegenwirkt. Bei VHL-Erkrankung ist zudem eine Überaktivierung des mTOR-Signalweges in der Literatur beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Mechanismus, über welchen VHL Einfluss auf den mTOR-Signalweg nimmt näher untersucht.

 

In Zellkultur konnte eine direkte Interaktion von VHL mit RAPTOR, der zentralen regulatorischen Untereinheit von mTOR Komplex 1 gezeigt werden. In Anwesenheit von VHL kam es zu einem raschen Abbau von RAPTOR. Experimente mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid weisen darauf hin, dass VHL posttranslational auf RAPTOR Einfluss nimmt. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Hemmung der Funktion von HIF-2α mittels des Inhibitors PT2385 keinen Einfluss auf RAPTOR hat. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass VHL RAPTOR nicht über Änderung von Transkription oder Translation beeinflusst.

 

Nachfolgend wurde untersucht, ob VHL RAPTOR über einen Mechanismus analog zu HIF reguliert. VHL ist Teil eines Ubiquitin-Ligase-Komplexes. Durch Ubiquitinierung werden Proteine wie z.B. HIF dem Abbau durch das Proteasom zugeführt. Auch für RAPTOR konnte in dieser Arbeit eine verstärkte Ubiquitinierung durch VHLgezeigt werden.

 

Für eine Bindung von VHL an HIFs ist eine Hydroxylierung von Prolinen in HIF durch die Prolylhydroxylasen EglN1-3 erforderlich. Diese Reaktion ist abhängig von der Sauerstoffkonzentration. Bei Hemmung der Prolylhydroxylasen mittels DMOG und CoCl2 war der Abbau von RAPTOR durch VHL deutlich reduziert. Ein ähnlicher, wenngleich schwächerer Effekt konnte unter Hypoxie verzeichnet werden. Bei Hypoxiebedingungen war die Interaktion von VHL mit RAPTOR abgeschwächt. In weiteren Experimenten konnte eine Interaktion zwischen RAPTOR und der Prolylhydroxylase EglN3 gezeigt werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass EglN3 zur Hydroxylierung von RAPTOR unter normoxischen Bedingungen führt und somit eine Interaktion zwischen RAPTOR und dem VHL-Ubiquitin-Ligase-Komplex ermöglicht, wodurch nachfolgend RAPTOR dem Ubiquitin-Proteasom-System zugeführt wird.

 

Durch Mutation des VHL-Gens und daraus resultierendem Funktionsverlust können verschiedene Krankheitsausprägungen im Rahmen des VHL-Syndroms resultieren. So gehen Typ 2B VHL-Mutationen mit einem erhöhten Risiko für ccRCC einher, während Typ 2A Mutationen eine schwächere Assoziation mit ccRCC haben. Um die molekulare Basis im Hinblick auf RAPTOR zu untersuchen, wurden zwei häufige Typ 2A Mutationen (Y98H und Y112H) und Typ 2B Mutationen (Y98N und Y112N) gewählt. Interessanterweise zeigte lediglich die VHL-Mutation Y112N einen Defekt hinsichtlich des Abbaus von RAPTOR, während sich die Mutationen Y98N, Y98H und Y112H wie Wildtyp VHL verhielten. Die Bindung zwischen beiden VHL Typ 2B Mutationen und RAPTOR war interessanterweise nicht beeinträchtigt. Somit scheinen die VHL-Mutationen sich nicht nur hinsichtlich ihres Einflusses auf HIF-Transkriptionsfaktoren, sondern auch auf den mTOR-Signalweg zu unterscheiden. Weitere Untersuchungen sind hierzu jedoch noch erforderlich.

 

Mit dieser Arbeit konnten wesentliche Erkenntnisse über mögliche Mechanismen der Dysregulation von mTORC1 über die zentrale Komponente RAPTOR im Rahmen der VHL Erkrankung erzielt werden. Diese könnten eine weitere zielgerichtete Therapie beim ccRCC eröffnen.

Clear cell renal cell carcinoma are caused by mutations of the von Hippel Lindau (VHL) gene. VHL is a tumor suppressor, that plays an important role in the regulation of the HIF-signaling pathway by leading to its inhibition and thus, suppresses tumor initiation and tumor progression. Moreover, in VHL disease overactivation of the mTOR-signaling pathway has been described in literature. The aim of this study was to elucidate the mechanism whereby VHL influences the mTOR-signaling pathway.

 

A direct interaction of VHL and RAPTOR, the central regulatory subunit of mTOR complex 1 was shown in cell culture experiments. In presence of VHL RAPTOR was rapidly degraded. Experiments with the translation inhibitor cycloheximide indicate, that VHL influences RAPTOR at the posttranslational level. Moreover, inhibition of the function of HIF-2α through the inhibitor PT2385 did not influence to RAPTOR levels. These observations support that VHL doesn´t influence RAPTOR levels by changing of transcription or translation.

 

Subsequent it was examined, if VHL regulates RAPTOR through a mechanism analog to HIF. VHL is part of an ubiquitin-ligase-complex. By ubiquitination, HIF proteins are marked for degradation through the proteasome. Similarly, we could show that RAPTOR is modified by ubiquitination through VHL.

 

For the interaction between VHL and HIF, the hydroxylation of prolines within HIF through the prolylhydroxylases EglN1-3 is required. This reaction depends on oxygen concentration. We observed that inhibition of the prolylhydroxylases by DMOG and CoCl2 resulted in strong reduction of the degradation of RAPTOR through VHL. A similar, although weaker effect has been detected under hypoxia. Under hypoxic conditions the interaction between VHL and RAPTOR was weakened. In further experiments an interaction between RAPTOR and the prolylhydroxylase EglN3 was observed. These observations support the hypothesis, that EglN3 leads to hydroxylation of RAPTOR under normoxic conditions and thus, enables an interaction between RAPTOR and the VHL-ubiquitin-ligase-complex through which subsequent RAPTOR is marked for degradation by the proteasome.

 

Mutations of the VHL gene and thereby loss of VHL function evoke different disease manifestations. Type 2B VHL mutations are accompanied by a high risk for ccRCC, while type 2A mutations have a weaker association with ccRCC. To examine the molecular basis towards RAPTOR, two frequent type 2A mutations (Y98H and Y112H) and type 2B mutations (Y98N and Y112N) were selected. Interestingly, only the VHL mutation Y112N showed a defect regarding the degradation of RAPTOR, while the mutations Y98N, Y98H and Y112H behaved like wildtype VHL. The interaction between both VHL type 2B mutations and RAPTOR interestingly wasn´t impaired. Thus, VHL mutations do not only differentially impact HIF-transcription factors, but also the mTOR-signaling pathway. Further studies are required to elucidate these observations.

 

With this doctoral thesis essential understandings of possible mechanisms of the dysregulation of mTORC1 through the central component RAPTOR within the VHL disease has been achieved. This could open further targeted therapy in ccRCC.

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