Posttranslational modifications of the Spinal Muscular Atrophy gene product SMN : Implications for therapy and pathophysiology

Die monogenetische neurodegenerative Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA) betrifft 1:10.000 Menschen im frühen Kindesalter und führt bei dem schwersten Verlauf zum Tod. Der SMA-Phänotyp ist charakterisiert durch einen Verlust des Survival of Motoneuron (SMN) Proteins durch Mutation oder Deletion im SMN1 Gen. Das Fehlen des SMN-Proteins resultiert in einem Untergang der α-Motorneurone im ventralen Horn des Rückenmarks und im Hirnstamm, welches zu einer proximalen und distalen Muskelatrophie führt. Da SMN ubiquitär exprimiert wird, sind periphere Organe und Gewebe ebenfalls von dem Verlust des SMN-Proteins betroffen und weisen Beeinträchtigungen z.B. in der Morphologie und der Funktionalität auf. Eine Behandlung zu einem späteren oder suboptimalen Zeitpunkt kann zu SMN-unabhängigen Pathologien führen, welche bisher nicht vollständig verstanden sind. Derzeitige SMA-Therapien führen zu einer Erhöhung der SMN-Proteinmenge, um die SMN-Stabilität zu steigern und damit den SMA-Phänotyp zu mildern. Dennoch gibt es intrazelluläre Mechanismen, welche die Proteinstabilität beeinflussen, z.B. post-translationale Modifikationen (PTM). Die SMN-Proteinsequenz weist Phosphorylierungsstellen auf, welche mittels Massenspektrometrie identifiziert werden konnten. Diese Phosphorylierungsstellen beeinflussen sowohl die intrazelluläre Translokalisation als auch die Funktionen von SMN. Bisher ist wenig zu den Kinasen und Phosphatasen bekannt, welche auf die SMN Phosphorylierungsmuster wirken.

Diese Arbeit soll insbesondere den Effekt der Phosphorylierung auf die Funktionen und die Lokalisation des SMN-Proteins untersuchen. Weiterhin soll die Identifikation von Phosphatasen und Kinasen, welche den Phosphorylierungsstatus von SMN beeinflussen, analysiert werden.

In der ersten Studie (Rademacher, Detering et al, 2020) konnten wir phospho-Serin 290 und phospho-Serin 292 (pS290 und pS292) als zwei neue Phosphorylierungsstellen im C-Terminus von SMN identifizieren. Die Veränderung des Phosphorylierungsstatus an SMN S290 zeigte einen Einfluss auf die Proteinstabilität, Oligomerisierung und Interaktion mit Zinc Finger Protein 1 (ZPR1). Wir konnten Phosphatase and Tensin Homologue (PTEN) als eine Phosphatase von SMN identifizieren, welche an SMN bindet und SMN dephosphoryliert. Ein PTEN-Knockdown führte zu einem zellulären SMA-Phänotyp, welcher durch eine niedrige SMN-Proteinmenge und eine reduzierte Anzahl an SMN-positiven Kernkörperchen gekennzeichnet ist.

Das zweite Kapitel (Manuskript II) konzentriert sich auf die Identifikation von interagierenden Proteinen, insbesondere auf Kinasen von SMN. Durch den Einsatz der Biotinligase BioID2 konnten in einem Interaktionsassay diverse Interaktionspartner von SMN identifiziert werden. Die Signalweganalyse mit Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ergab 131 kanonische Signalwege für das SMN-Interaktom. Wir konnten die Interaktion von SMN und der Hexokinase II (HKII) bestätigen, welche auf eine neue funktionelle Interaktion von SMN mit dem Glykolyse-Enzym HKII hindeuten kann.

Die dritte Studie (Review) ist eine Übersichtsarbeit, welche die derzeitigen Daten zur Rolle der Phosphorylierung und anderen posttranslationalen Modifikationen in einen analytischen Zusammenhang mit der Struktur und den Funktionen von SMN stellt. Der Review hebt die Relevanz posttranslationaler Modifikationen für die SMA dar und hebt die Modulation der Phosphorylierung von SMN als einen neuen Zielmechanismus für eine kombinatorische Behandlung der SMA hervor.

Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Analyse des Effekts von Phosphorylierung auf Funktionen und der damit einhergehenden intrazellulären Lokalisation von SMN. Wir konnten insbesondere zeigen, dass ein PTEN-Knockdown zum SMA-Phänotyp beitragen kann. Eine PTEN-Depletion würde sich daher für eine SMA-Therapie als nachteilig erweisen. Die Regulation von involvierten Kinasen, welche den Phosphorylierungsstatus von SMN beeinflussen, ist potenziell relevant für die SMN-Proteinstabilität. Die SMN-Proteinstabiliät kann durch die Modulation der SMN-Phosphorylierungsmuster als neuer Strategie für zukünftige kombinatorische Therapien der SMA genutzt werden.