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Isolation, Aufreinigung und Kultivierung von Fibroblasten aus dem Spiralganglion

Die Beeinträchtigung des Hörvermögens durch Hörminderung und Taubheit stellt einen weit verbreiteten Krankheitskomplex dar. Allein in Deutschland sind mehr als 19 % der Gesamtbevölkerung von Schwerhörigkeit betroffen. Durch die Einführung des Cochlea-Implantats (CI), einer elektronischen Innenohrprothese, ist es möglich Patienten mit vollständig sensorineuralem Hörverlust ein Hörempfinden und somit ein Sprachverständnis zu vermitteln. Der Nutzen eines CI lässt jedoch große interindividuelle Unterschiede erkennen, was zum einen in der Anzahl funktionsfähiger Spiralganglionneurone (SGN) und zum anderen in der Nerv-Elektroden-Interaktion begründet liegt. Bei Cochlea-Implantation bildet sich ein Bindegewebemantel um den Elektrodenträger, was eine Vergrößerung des Widerstandes für die elektrische Stimulation des Hörnervs zur Folge hat. Um langfristig eine Optimierung der Nerv-Elektroden-Grenzfläche zu erzielen und einen engen Nerv-Elektroden-Kontakt zu schaffen, wird in verschiedenen Forschungsvorhaben der Einfluss von Medikamenten, Oberflächenmodifikationen oder elektrischer Stimulation auf innenohr-spezifische Zellen untersucht. Hierfür ist es notwendig, die Auswirkungen auf die unterschiedlichen Zelltypen separat untersuchen zu können. Protektive Effekte auf SGN neonataler SPRAGUE-DAWLEY-Ratten konnten bereits nachgewiesen werden. Die Gewinnung der Zellen gehört dabei zu den vorhandenen Standardverfahren, wobei man neben den SGN vorrangig auch Gliazellen und Fibroblasten erhält. Um die Effekte auf das Wachstums- und Adhäsionsverhalten cochleärer Fibroblasten untersuchen zu können, sollen für die In-vitro-Versuche aufgereinigte Fibroblasten aus dem Spiralganglion (SpG) zur Verfügung gestellt werden.

Die Ziele der vorliegenden Arbeit lagen in dem immunzytochemischen Nachweis der Zellen des Spiralganglions neonataler SPRAGUE-DAWLEY-Ratten sowie in der Gewinnung und Aufreinigung von Fibroblasten aus dieser Zellmischkultur. Zusätzlich sollten die cochleären Fibroblasten immunzytochemisch weiter charakterisiert werden.

 

Für den Nachweis der Zellen in der dissoziierten Spiralganglionzellkultur wurde ein immunzytochemisches Färbeprotokoll etabliert. Die optimalen Anwendungskonzentrationen der einzelnen Antikörper (Ak) wurden in verschiedenen Verdünnungsreihen ermittelt und an entsprechenden positiven Zelllinien getestet. Die dissoziierten Spiralganglionzellen wurden in beschichteten Multiwellplatten nach 48 h Kultivierungsdauer fixiert und mittels indirektem Mehrfach-Immunfluoreszenzverfahren anhand zellspezifischer, intrazellulärer Proteine immunzytochemisch gefärbt. Zusätzlich wurden alle Zellkerne mit der DAPI-Kernfärbung markiert. Für eine Differenzierung der Zellen erwiesen sich Ak gegen das 200kD-Neurofilament (NF) der SGN, das S100B-Protein der Gliazellen (GZ) sowie gegen das Intermediärfilament (IF) Vimentin in Fibroblasten und GZ als geeignet. Mit dieser Ak-Kombination konnten alle Zellen in der Spiralganglionzellkultur immunzytochemisch markiert und anhand ihres Fluoreszenzsignals sowie ihrer morphologischen Eigenschaften unterschieden werden. Der Anteil an GZ lag dabei mit 60-70 % über dem Anteil an Fibroblasten.

Für die Gewinnung und Aufreinigung der Fibroblasten aus dem SpG wurden zunächst die Kulturbedingungen geändert. Dabei wurde auf eine Beschichtung der Kulturgefäße verzichtet und das sonst übliche Medium auf fibroblastenspezifisches Medium umgestellt. Die Zellmischkultur wurde in 25-cm2-Zellkulturflaschen (T25) kultiviert und subkultiviert, wobei eine optimale Einsaatdichte von 3x105 Zellen/T25 ermittelt wurde. Bereits nach der ersten Passage (P1) konnten keine SGN mehr nachgewiesen werden, während sich der Anteil an GZ auf etwa 20-30 % reduzierte, bei höheren Passagen aber dann konstant blieb.

Für eine weitere Aufreinigung wurde die Wirkung des Ca2+-Chelators EGTA untersucht. Die Zellen wurden sowohl in Laminin-beschichteten als auch in unbeschichteten Kulturgefäßen kultiviert und subkultiviert, wobei in den beschichteten Ansätzen keine selektivere Ablösung der Gliazellen beobachtet werden konnte. Bei beiden Ansätzen konnte zwar eine hohe Aufreinigung der Fibroblasten von etwa 90-95 % erreicht werden, aber eine weitere Vermehrung und Kultivierung der Fibroblasten war anschließend nicht mehr möglich.

Für die Anwendung der fluoreszenzbasierten, durchflusszytometrischen Zellsortierung wurden die Zellen der primären Spiralganglionzellkultur (P0) mit Ak gegen den p75NGF-Rezeptor sowie das Thy1-Protein an ihrer Oberfläche markiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten ausschließlich Thy1-positiv und Gliazellen ausschließlich p75NGFR-positiv waren, während die SGN beide Proteine exprimierten. Durch Kultivierung und Subkultivierung wurden die SGN aus der Zellmischkultur (P1) entfernt und die Fibroblasten vermehrt. Für die Zellsortierung wurden die vitalen Zellen der zweiten Passage (P2) mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern gegen die zellspezifischen Oberflächenproteine markiert und anschließend, entsprechend ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzsignale, im Durchflusszytometer getrennt. Dabei konnte eine Aufreinigung der Fibroblasten von > 99 % erreicht werden.

Bei der immunzytochemischen Charakterisierung der aufgereinigten Fibroblasten konnte gezeigt werden, dass diese positiv für das IF Vimentin, das Enzym Carboanhydrase-II (CAII), das S100-Protein sowie das Gap-junction-Protein Connexin-26 (Cx26) waren und damit dem immunhistochemischen Profil der Fibroblasten des Spiralligaments vom Typ I entsprachen. Eine Kultivierung und Subkultivierung der aufgereinigten Fibroblasten war bis zu 16 Passagen über 11 Wochen möglich. Bei Kryokonservierung der Fibroblasten (P5) lag die Überlebensrate bei etwa 80 % der Zellen, wobei diese ihre typische Fibroblastenmorphologie und Merkmale der Zellteilung beibehielten.

Da Zellkulturen aus tierschutzrelevanten Aspekten vermehrt serumfrei kultiviert und durch die Verwendung chemisch-definierter, bestenfalls tierkomponentenfreier, Ersatzseren möglichst standardisiert werden sollten, wurden die aufgereinigten Fibroblasten in einem ersten Ausblick ebenfalls serumfrei kultiviert, subkultiviert und kryokonserviert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an Fibroblasten bei Subkultivierung im Vergleich zu den serumhaltigen Ansätzen zwar um 20 % reduziert war, aber die Zellen weder in ihren morphologischen Eigenschaften noch in ihrer Adhärenz verändert waren. Auch bei der serumfreien Kryokonservierung konnte eine Überlebensrate von 80 % erreicht werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Fibroblasten aus dissoziierten Spiralganglionzellen durch Kultivierung und Subkultivierung sowie durch die Methode der fluoreszenzbasierten, durchflusszytometrischen Zellsortierung isoliert, aufgereinigt und vermehrt werden können. Durch die Kryokonservierung ist zudem eine Langzeitlagerung der Zellen möglich, ohne ihre Vitalität und spezifischen Eigenschaften erheblich zu beeinflussen. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit erstmalig aufgereinigte Fibroblasten aus dem Spiralganglion für zukünftige In-vitro-Versuche zur Verfügung gestellt werden, welche den Eigenschaften der Zellen in vivo am ehesten entsprechen.

Hearing impairment due to hearing loss and deafness is a widespread disease complex. In Germany alone, more than 19 % of the total population is affected by hearing loss. With the introduction of the cochlear implant (CI), an electronic inner-ear prosthesis, it is possible to convey a hearing sensation and thus an understanding of speech to patients with complete sensorineural hearing loss. However, the success of a CI shows large individual differences, which is due to the number of functional spiral-ganglion neurons (SGN) and the nerve-electrode interface. After cochlear-implant supply, connective tissue forms around the electrode carrier, which results in an increase in resistance for electrical stimulation of the auditory nerve. In order to achieve long-term optimization of the nerve-electrode interface and to create close nerve-electrode contacts, various research projects investigate the influence of drugs, surface modifications or electrical stimulation on cells specific to the inner ear. Therefore, it is necessary to be able to study the effects on the different cell types separately. Protective effects on SGN of neonatal SPRAGUE-DAWLEY rats have already been demonstrated. The extraction of the cells is part of the existing standard procedures, whereby in addition to the SGN, glial cells and fibroblasts are primarily obtained. To investigate the effects on the growth and adhesion behavior of cochlear fibroblasts, purified fibroblasts from the spiral ganglion should be made available for in-vitro experiments.

The objectives of the present work were the immunocytochemical detection of the cell types from the spiral ganglion of neonatal SPRAGUE-DAWLEY rats and the extraction and purification of fibroblasts from this mixed cell culture. In addition, the cochlear fibroblasts should be characterized by immunocytochemistry.

 

An immunocytochemical staining protocol was established for the detection of the cell types in the dissociated spiral-ganglion-cell culture. The optimally effective concentrations of the individual antibodies were determined in different dilution series and tested on correspondingly positive cell lines. The dissociated spiral-ganglion cells were cultured in coated multiwell plates, fixed after 48 hours of cultivation, and immunocytochemically stained by means of indirect multiple-immunofluorescence methods using cell-specific, intracellular proteins. In addition, all cell nuclei were stained with DAPI. For differentiation of the cells, antibodies against the 200kD-neurofilament (NF) of the SGN, the S100B-protein of the glial cells (GZ) and the intermediate filament (IF) vimentin in fibroblasts and GZ were proven to be suitable. It could be shown that, with this antibody combination, all cells in the spiral-ganglion-cell culture could be immunocytochemically marked and differentiated on the basis of their fluorescence signals and their morphological properties. The proportion of glial cells was with 60-70 % higher than the proportion of fibroblasts.

For the extraction and purification of the fibroblasts from the spiral ganglion the culture conditions were initially changed. The culture vessels were not coated and the typically used medium was substituted by fibroblast-specific medium. From the mixed cell culture cultivated and subcultivated in 25-cm2-cell-culture flasks (T25), an optimal seeding density of 3x105 cells/T25 was determined. Already after the first passage (P1), SGN could no longer be detected, while the proportion of GZ decreased to about 20-30 %, but remained constant with higher passages.

The effect of the Ca2+-chelator EGTA was investigated for further purification. The cells were cultivated and subcultivated both in laminin-coated and in uncoated-culture vessels, but no differences in selective detachment of the glial cells could be observed between the conditions. With both approaches, a high purification of the fibroblasts of about 90-95 % could be achieved, but no further proliferation and cultivation of the fibroblasts could be achieved there after.

For application of the fluorescence-based, flow-cytometric-cell sorting, the cells of the primary-spiral-ganglion-cell culture (P0) were labeled with antibodies against the p75NGF receptor and the Thy1 protein on their surfaces. It could be shown that fibroblasts were only Thy1-positive and glial cells p75NGFR-positive, while the SGN expressed both proteins. The SGN were removed from the mixed cell culture (P1) by cultivation and subcultivation, while the numbers of fibroblasts were increased. For cell sorting, the vital cells of the second passage were labeled with fluorochrome-conjugated antibodies against their cell-specific surface proteins and separated according to their different fluorescence signals in the flow cytometer. A purification of the fibroblasts of > 99 % was achieved.

The immunocytochemical characterization of the purified fibroblasts showed that they were positive for the IF vimentin, the enzyme carbonic-anhydrase II (CAII), the S100 protein and the gap-junction protein connexin-26 (Cx26). Thus, the immunohistochemical profile of the fibroblasts corresponded to the one of type-I fibroblasts of the spiral ligament. Cultivation and subcultivation of the purified fibroblasts was possible up to 16 passages over 11 weeks. When the fibroblasts (P5) were cryopreserved, the survival rate was about 80 %, with the cells still showing their typical fibroblast morphology and features of cell division post treatment

From an animal-welfare perspective, cell cultures should increasingly be grown serum-free and further standardized by the use of chemically defined and – if possible – animal-component-free replacement sera. The purified fibroblasts of the present study were also initially cultivated, subcultivated and cryopreserved serum-free. It could be shown that the number of these fibroblasts was reduced by 20 % during subculturing in comparison to serum-containing approaches, but the cells neither changed their morphological properties nor their adherence. A survival rate of 80 % was also achieved with serum-free cryopreservation.

In summary, fibroblasts from dissociated spiral-ganglion cells can be isolated, purified and proliferated by cultivation and subcultivation as well as by the method of fluorescence-based-flow-cytometric-cell sorting. The cryopreservation also enables long-term storage of the cells without affecting their vitality and specific properties. Thus, in the present work, purified fibroblasts from the spiral ganglion, with properties most closely corresponding to the once of the cells in vivo, could be made available for future in-vitro experiments for the first time.

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