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Molecular mechanisms and dysregulated networks in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Spinal Muscular Atrophy

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Spinal Muscular Atrophy (SMA) are both characterized by the degeneration of motoneurons in the motor cortex, brain stem and spinal cord. The underlying mechanisms that cause degeneration of motoneurons and result in muscle atrophy are diverse and not fully understood. However, most patients decease due to respiratory failure. In this thesis, not only molecular mechanisms in ALS are considered including actin cytoskeleton and stress granule dynamics, but also altered pathways and potential therapeutic strategies in SMA are discussed. Moreover, a comparative study elucidates overlapping processes in both diseases. Thus, this study aims to identify common mechanisms in both neurodegenerative diseases. Manuscript I analyzed characteristics of ALS pathogenesis including stress granules and protein aggregates. Aggregate formation has harmful consequences on proper protein functions. Moreover, a switch of soluble stress granules into permanent granules is suggested as a potential pathomechanism in neurodegenerative diseases. Here, we showed that the actin-binding proteins profilin 1 and profilin 2 relocate into stress granules. In addition, only ALS-associated proteins specifically sequestered the neuronal profilin 2 isoform. Manuscript II elucidates functional links and gives a global overview of altered pathways in ALS and SMA. Protein connectivity was visualized by a protein network built from of several key proteins that are involved in fatty acid metabolism, skeletal muscle metabolism, B-Raf signaling, actin or stress granule dynamics, respectively, as well as ALS and SMA causing proteins. We identified Superoxide dismutase 1 and profilin 1, which are both mutated in ALS, as central proteins within this network. In SMA, cellular and pathological changes are not only found in neuronal tissues, but alterations have been also described in non-neuronal organs. Manuscript III analyzed in more detail alterations within the liver lipid metabolism of SMA patients and SMA mouse models. Both organisms showed signs of aberrant liver function, including pathological changes and misregulated fatty acid metabolism. Manuscript IV describes a potential therapeutic approach for SMA. Previous studies revealed a dysregulation of Krüppel-like factor 15 (KLF15) in skeletal muscles, wherein this transcription factor is involved in energy metabolism. Thus, a muscle-specific overexpression of KLF15 by an Adeno-associated virus was performed and its distribution was measured and compared to phenotypes of wild-type and SMA mouse models. Although KLF15 overexpression had marginal effects on SMA phenotypes, it was detected not only in muscles, but also in peripheral organs. Manuscript V considers the neurotrophic signaling in SMA and focuses on an altered signaling network with the serine/threonine kinase B-Raf in its center. B-Raf is important for motoneuron survival as shown by a downregulation in SMA patient cells, SMA mice and Caenorhabditis elegans accompanied with motoneuron degeneration in the latter model. However, a rescue experiment in the nematode C. elegans by an overexpression of a B-Raf homologue resulted in an elevated motoneuron number. These results underline the important role of B-Raf in motoneuron functionality and signaling. In conclusion, these studies demonstrate that various mechanisms are involved in pathogenesis of ALS and SMA. However, at the same time they reveal that a cure of these diseases is a challenging process where numerous pathways have to be taken into account. Moreover, restoration of one pathway or protein function may improve certain symptoms but may not cure the disease in total. In the case of SMA, in which the Survival of Motoneuron (SMN) protein is the disease-causing factor, it also became clear that reduced SMN levels have effects on various downstream targets and pathways. However, protein network analysis identifies altered processes and elucidates connections to other diseases for which these processes may be dysregulated as well. This knowledge helps to identify potential treatment strategies for future approaches.

Die Degeneration von Motoneuronen im motorischen Cortex, dem Hirnstamm und dem ventralen Horn des Rückenmarks ist für die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Spinale Muskelatrophie (SMA) charakteristisch. Ein Verlust der Motoneurone geht mit einer Atrophie der Muskeln einher, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen vielfältig und oft nicht vollständig aufgeklärt sind. In der vorliegenden Arbeit werden molekulare Prozesse, wie das Aktinzytoskelett und die Stressgranuladynamik, hinsichtlich ihres Beitrages an der Entstehung der ALS untersucht. Zusätzlich werden pathologische Auffälligkeiten, veränderte Signalwege und potentielle Therapiemöglichkeiten bei der SMA diskutiert. In einer vergleichenden Studie werden Überschneidungen von Prozessen beschrieben, die sowohl in der ALS als auch in der SMA beschrieben sind. Ziel dieser Arbeit ist es gemeinsame Mechanismen beider neurodegenerativer Erkrankungen zu identifizieren. Im ersten Manuskript wurden die für die ALS charakteristische Bildung von Stressgranula und Proteinaggregaten sowie mögliche Konsequenzen analysiert. Die Bildung von Proteinaggregaten hat einen erheblichen Einfluss auf die Funktionalität und Eigenschaften von Proteinen. Physiologische Stressgranula besitzen die Fähigkeit sich nach dem Wegfall des Stressors wieder aufzulösen; geht diese Funktion allerdings verloren, können sich permanente Granula bilden. Dieser Prozess beschreibt einen möglichen pathologischen Mechanismus verschiedenster neurodegenerativer Erkrankungen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Aktin-bindenden Proteine Profilin 1 und Profilin 2 in Stressgranula lokalisiert sind. Außerdem wurde die hauptsächlich neuronal exprimierte Profilin 2-Isoform von ALS-assoziierten Proteinen sequestriert. In einer vergleichenden Studie (Manuskript II) wurden mittels einer in silico-Analyse funktionelle Zusammenhänge in veränderten Signalwegen, biologischen Prozessen und dem Metabolismus in der ALS und SMA untersucht. Das in silico-Tool ermöglicht die Repräsentation von Proteinverknüpfungen in einem Netzwerk. Das Netzwerk in dieser Studie enthält verschiedene Proteine, die Schlüsselfunktionen im Fettstoffwechsel, dem Metabolismus der Skelettmuskulatur, dem B-Raf signaling sowie der Aktin- und Stressgranuladynamik besitzen. Außerdem wurden Proteine einbezogen, die an der Pathogenese der ALS und SMA beteiligt sind. Innerhalb des Proteinnetzwerkes konnten die Superoxiddismutase 1 und Profilin 1, welche beide ALS-asssoziierte Mutationen aufweisen, als zentrale Proteine identifiziert werden. In der SMA sind zelluläre und pathologische Veränderungen nicht nur im neuronalen Gewebe zu beobachten, sondern es treten auch Anomalien in nicht-neuronalen Organen auf. Veränderungen im Leberlipidstoffwechsel von SMA-Patienten und SMA-Mausmodellen wurden in Manuskript III untersucht. Sowohl im murinen SMA-Modell als auch in Studien mit SMA-Patienten zeigten sich Veränderungen der Leber, wie pathologische Anomalien und ein fehlregulierter Fettstoffwechsel. Für die SMA gibt es bereits drei zugelassene Arzneimittel, welche jedoch einige Einschränkungen haben. In einem weiteren Projekt (Manuskript IV) wurde eine mögliche Behandlung für die SMA untersucht. In einer vorigen Arbeit konnte gezeigt werden, dass im Skelettmuskel der Transkriptionsfaktor Krüppel-like factor 15 (KLF15) verändert exprimiert wird. KLF15 ist unter anderem am Energiestoffwechsel beteiligt. Daher wurde in diesem Projekt untersucht, ob eine muskelspezifische Überexpression von KLF15 durch ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) einen Einfluss auf den Phänotypen verschiedener SMA-Mausmodelle hat. Verglichen mit Kontrolltieren zeigte ein analysiertes SMA-Mausmodell eine geringfügige Verbesserung des Phänotyps. Außerdem konnte gezeigt werden, dass KLF15 nach einer muskelspezifischen Überexpression nicht nur im Muskel, sondern auch in verschiedenen anderen peripheren Organen nachgewiesen werden konnte. In einer letzten Studie (Manuskript V) wurde das neurotrophe signaling bei der SMA genauer untersucht. Dabei konnten dysregulierte Signalkaskaden identifiziert werden, worin die Serin/Threonin Kinase B-Raf eine zentrale Rolle einnimmt. Expressionsanalysen in Zellen von SMA-Patienten sowie in SMA-Modellen der Maus und dem Nematoden Caenorhabditis elegans zeigten eine Herunterregulation von B-Raf. Diese verringerte Expression war mit einer verminderten Anzahl von Motoneuronen im C. elegans-Modell verbunden. Diese Ergebnisse betonen die wichtige Funktion, die B-Raf im Überleben von Motoneuronen hat. Zusätzlich wurde dies in einem Experiment in C. elegans bestätigt, welches  nach einer Expression eines orthologen B-Raf Proteins eine Zunahme der Motoneuronenanzahl in diesem Modell zeigte. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass unterschiedliche Mechanismen sowohl in der Pathogenese der ALS als auch der SMA beteiligt sind. Gleichzeitig wird deutlich, dass eine Therapie dieser beiden neurodegenerativen Erkrankungen ein aufwendiger Prozess ist, da eine Vielzahl von pathways berücksichtig werden muss. Eine Wiederherstellung eines spezifischen Prozesses oder Signalweges beziehungsweise einer Proteinfunktion verbessert eventuell einen bestimmten Phänotyp, wird aber wahrscheinlich nicht die Krankheit heilen. Am Beispiel der SMA zeigen viele Studien, dass eine verminderte Expression des Krankheits-verursachendenSurvival of Motoneuron-Proteins einen Einfluss auf viele nachgeschaltete Proteine und Prozesse hat. Durch den Einsatz von Netzwerkanalysen können veränderte Prozesse identifiziert werden und Verbindungen zu anderen Erkrankungen, in welchen diese Prozesse möglicherweise ebenfalls verändert sind, aufgezeigt werden. Das so erhaltene Wissen kann bei der Identifikation von potenziellen Therapiestrategie in zukünftigen Ansätzen genutzt werden.

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