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Etablierung minimal-invasiver optischer Verfahren zur Untersuchung von in vivo Regenerationsvorgängen auf Einzelzellebene im Tiermodell

Um aktuelle Fragestellungen in der Forschung zu beantworten, ist intravitale Mikroskopie mit zellulärer Auflösung nötig. Sie ermöglicht eine präzise zeitliche Auswertung, sodass zum Beispiel Regenerationsprozesse sichtbar werden. Hierbei stellt sich die Herausforderung, komplexe Bildgebungsaufbauten bis an das zu untersuchende Gewebe zu führen. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein faseroptisches Fluoreszenzmikroskop etabliert. Dies soll eine Möglichkeit der minimal-invasiven, hochauflösenden Bildgebung aufzeigen, welche in Forschung und Klinik bestehende Untersuchungsverfahren verfeinert, ergänzt und eventuell ersetzt, sowie zu einer erhöhten Datenausbeute und -qualität führt.

Für die Umsetzung eines faserbasierten Fluoreszenzmikroskops wurde zunächst ein optischer Aufbau etabliert. Hierbei wurde eine multispektrale Beleuchtung gewählt, welche fünf Anregungsmaxima beinhaltet. Durch geeignete Filter und einen dichroitischen Spiegel können vier dieser Lichtquellen ohne Filterwechsel verwendet werden. Bei der Faseroptik handelt es sich um Glasfaserbündel, bestehend aus 30.000 beziehungsweise 10.000 einzelnen Faserkernen. Die Faserbündel enthalten einen Kunststoffmantel, sodass sich ein Durchmesser von 1 mm beziehungsweise 0,5 mm ergibt. Zur Charakterisierung wurden verschiedene Zelllinien (HeLa, A549) und tierische Gewebe (Maus, Ratte, Schwein) dargestellt. Hierbei wurden eine Vielzahl an Farbstoffen verwendet sowie Doppelfärbungen durchgeführt. Auch wiederholte abdominale in vivo Bildgebungen an GFP-exprimierenden Mäusen wurden realisiert.

Das selbstentworfene Fasermikroskop hat eine laterale Auflösung von 3,1 µm. Die Beleuchtungsstärke variiert zwischen 100 und 700 mW/cm2 bei einer maximalen Reflektion von unter 1% (Ausnahme: ultraviolette Lichtquelle 14%). Die Visualisierung mehrfachgefärbter Zellen war durchführbar, wobei es in Einzelfällen zu Überlappungen der Farbstoffspektren kam. Es gelang die Darstellung verschiedener Gewebe (Leber, Pankreas, Lunge und andere Organe) ex vivo. Neben der Anfärbung der Zellen und Zellverbände (unter anderem mit DiI, Fluorescein und Indocyaningrün) konnten auch Gefäße und deren Aufzweigungen gut dargestellt werden. Auch eine bronchiale Bildgebung wurde erfolgreich umgesetzt. Hierbei konnte die optische Faser durch den Arbeitskanal eines Bronchoskops geführt werden. Darüber hinaus konnten wiederholte in vivo Bildgebungen über einen Zeitraum von bis zu 10 Wochen durchgeführt werden. Hierzu wurde eine abdominale Doppelbildgebung etabliert, welche aus einem kommerziellen Endoskop (zur Platzierung) und dem Fasermikroskop (zur Detaildarstellung) bestand. Dabei zeigte die Belastungsbeurteilung der Versuchstiere, dass das Wohlbefinden nur minimal beeinträchtigt wurde. Die zusätzliche Auswertung der faseroptischen Bilddaten mithilfe von Algorithmen ermöglicht sowohl eine Bildbearbeitung als auch die Bewertung des Blutflusses.

Insgesamt konnten verschiedenste Anwendungsmöglichkeiten für die faserbasierte Fluoreszenzmikroskopie aufgezeigt werden. Im Vergleich zu kommerziellen Aufbauten ist die faseroptische Variante sowohl mobil, flexibel als auch kostengünstig. Der geringe Faserdurchmesser erlaubt dabei eine Kombination mit kommerziellen Endoskopen. Durch die Faserlänge kann der Aufbau auch bei begrenzten Platzverhältnissen angewendet werden. Somit kann die Datengewinnung in bestehenden Versuchsprotokollen qualitativ und quantitativ verbessert werden. Auch können mit dieser Bildgebung bisher unzugängliche Untersuchungsgebiete hochauflösend dargestellt und hierdurch beurteilt werden.

 

 

The use of experimental animals is currently necessary in several research areas. Likewise, cellular resolution is required for many imaging questions. To enable the best possible data analysis, intravital microscopy is the method of choice. It can combine high resolution with repetitive imaging to obtain precise data. However, it poses the challenge to guide complex imaging setups to the tissue under investigation. To facilitate this problem, a fiber-optic fluorescence microscope was established in this work. The setup is intended to demonstrate a possibility for minimally invasive, high-resolution imaging that can be used in research and clinical settings, for the refinement of examination procedures and for the increasing data yield.

To implement the fiber-based fluorescence microscope, an optical setup was established. Multispectral LED illumination was chosen, which includes five excitation maxima. By using suitable filters and a dichroic mirror, four of these light sources can be used without changing filters. The fiber optic bundles consist of 30,000 and 10,000 individual fiber cores and contain a plastic cladding, resulting in diameters of 1 mm and 0.5 mm, respectively. For characterization, different cell lines (HeLa, A549) and animal tissues (mouse, rat, pig) were imaged. A variety of dyes were used, and double staining was performed. Repeated, abdominal in vivo imaging in GFP-expressing mice was also realized.

The self-designed fiber microscope had a lateral resolution of 3.1 µm. Illuminance varied between 100 and 700 mW/cm² with a maximum reflectance of less than 1% (exception: ultraviolet light source 14%). Visualization of multi-stained cells was feasible, with a minor overlap of the dye spectra in some cases. Visualization of various tissues (liver, pancreas, lung and others) ex vivo was successful. In addition to staining cells and cell aggregates (with the dyes DiI, fluorescein, and indocyanine green), vessels and their branching could also be well visualized. Bronchial imaging was also successfully implemented. Here, the optical fiber could be passed through the working channel of a bronchoscope. In addition, repeated in vivo imaging could be performed. For this purpose, abdominal dual imaging was established, which consisted of a commercial endoscope (for placement) and the fiber microscope (for detailed imaging). The stress assessment of the experimental animals showed that the well-being was only minimally disturbed. The additional evaluation of the fiber-optic image data using algorithms, enables image enhancement as well as the evaluation of blood flow.

Overall, a wide variety of applications for fiber-based fluorescence microscopy could be demonstrated. Compared to commercial setups, the fiber-optic is mobile, flexible, and cost-effective. The small fiber diameter allows a combination with commercial endoscopes. Due to the fiber length, the setup can also be used in limited space conditions. This allows an increase of the data yield in existing experimental protocols as well as a refinement of the data acquisition.

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