Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)TiHo eLib

Modulation of innate immune responses within the central nervous system in a mouse model of neurotropic virus infection

Virale Enzephalitiden führen zu akuten sowie langfristigen neurologischen Störungen, einschließlich kognitiver Beeinträchtigungen. Die Erforschung pathophysiologischer Prozesse und der Immunantwort bei neutrotropen Virusinfektionen ist für die Entwicklung effizienter Behandlungen erforderlich. Die experimentelle Theiler’sche Murine Enzephalomyelitis-Virus (TMEV)-Infektion stellt ein etabliertes Versuchsmodell der Multiplen Sklerose und Epilepsie dar. Mäuse mit einem genetischen C57BL/6-Hintergrund entwickeln eine akute Polioenzephalitis. CARD9 ist ein zentrales Adapterprotein, das die Signalübertragung mehrerer C-Typ-Lektinrezeptoren (CLRs; z.B. Dectin-1, Dectin-2, Mincle) reguliert. CLRs gehören zu den Mustererkennungsrezeptoren, die eine zentrale Rolle in Antigen-präsentierenden Zellen spielen. Der Verlust von CARD9 beeinträchtigt hauptsächlich Th1- und Th17-Reaktionen bei hyperinflammatorischen Erkrankungen und Infektionskrankheiten, insbesondere bei mykotischen Infektionen. Die Rolle von CARD9 in der Modulation von Immunreaktionen bei viralen Enzephalitiden ist bisher jedoch nicht im Detail untersucht worden. Die aktuelle Studie beschäftigt sich daher mit der Wirkung der CARD9-Defizienz auf die Neuroinflammation und angeborene Immunantwort bei C57BL/6 Mäusen nach TMEV-induzierte Enzephalitis.  

CARD9-/--Mäuse und C57BL/6-Wildtyp-Mäuse (WT) wurden nach intrazerebraler TMEV-Inokulation nach 3, 7 und 14 Tagen getötet und mittels Histologie, Immunhistochemie, molekularer Methoden und Durchflusszytometrie untersucht. CARD9-/--Mäuse zeigten einen vermehrten, neuronalen Verlust und eine Axonschädigung im Hippocampus während einer akuten Infektion. Der axonale Schaden blieb bei TMEV-infizierten CARD9-/--Mäusen bis zur späten Phase der Infektion nachweisbar. Die Anzahl Doublecortin+ neuronaler Vorläuferzellen im Gyrus dentatus von CARD9-/- Mäusen war infolge der Infektion signifikant reduziert. Mittels Immunhistologie und RT-qPCR konnte eine transiente Zunahme von TMEV-infizierten Zellen und der Virus-RNS in Gehirn von CARD9-/--Mäusen nachgewiesen werden. Allerdings fand sich keine vermehrte Ausbreitung des Virus im Hirnstamm und Rückenmark von CARD9-/--Mäusen. Die Befunde zeigen, dass ein CARD9-Mangel die Viruselimination nicht nachhaltig beeinträchtigt, aber eine verstärkte Neurodegeneration und Störung der Neurogenese nach TMEV-Infektion hervorruft. Zusätzlich konnte eine Zunahme von CD3+ T-Zellen und CD45R+ B-Zellen im Hippocampus von CARD9-/--Mäusen in der akuten und späten Phase der Infektion nachgewiesen werden. Des Weiteren lag im Hippocampus von CARD9-/--Mäusen eine erhöhte Infiltration von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen und Arginase 1+ myeloischen Zellen vor.  Keine Unterschiede zwischen CARD9-/-- und WT-Mäusen ergaben sich bei der Anzahl von CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD107b+ Makrophagen, ROR-g+ Th17-Zellen und Granzym B+-Zellen im Gehirn. Mittels Durchflusszytometrie fand sich ein Anstieg an CD8+ T-Zellen, CD4+CD62Llow T-Zellen und CD8+CD62Llow T-Zellen in der Milz von CARD9-/--Mäusen während der späten Infektionsphase. Akut infizierte CARD9-/- Mäuse zeigten eine erhöhte IL-5-mRNS-Expression sowie eine vermehrte Transkription pro-inflammatorischer Zytokine, einschließlich Interleukin (IL)-1β und Interferon (IFN)-g. Keine Unterschiede zwischen CARD9-/-- und WT-Mäusen fanden sich bei der Genexpression von IL-1α, IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1 und TNF-α im Gehirn. Im Vergleich zu mykotischen und bakteriellen Infektionen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass ein CARD9-Mangel Th1- und Th17-Reaktionen bei der TMEV-induzierten Enzephalitis nicht negativ beeinträchtigen. Zusätzlich wurden reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Lipidperoxidation und oxidative DNA-Schäden in Hippocampus infizierter Mäuse immunhistologisch untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Reduktion von Malondialdehyd+-Zellen in CARD9-/--Mäusen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die CARD9-Signalübertragung einen nur begrenzten Einfluss auf die antivirale Immunantwort im Verlauf der akuten TMEV-Infektion hat und nicht primär an der effektiven Viruselimination in C57BL/6-Mäusen beteiligt ist. Allerdings moduliert CARD9 die lokale Immunantwort im Gehirn und fördert damit die hippokampale Integrität und Neurogenese im Verlauf der TMEV-Infektion. Es bedarf weiterer Studien, um die zugrundeliegenden Mechanismen der CARD9-assoziierten Signalwege und deren Bedeutung für die Neuroprotektion bei der TMEV-Infektion und weiterer neurotroper Virusinfektionen aufzuklären.

Viral encephalitis is a worldwide neurological disease that affects people of all ages with high morbidity and mortality. In addition, pathogen-induced injury of the central nervous system (CNS) leads to long-term neurological disorders, including cognitive impairment. Detailed knowledge about the regulation of immune responses in neurotropic virus infections is required for the development of efficient treatment strategies. Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) is a non-enveloped, single-stranded picornavirus that transiently infects the brain, causing neuronal damage in C57BL/6 mice, making TMEV infection a valuable model to study virus-induced neurologic disorders. Caspase recruitment domain-containing protein 9 (CARD9) is a central adaptor protein that regulates the downstream signaling of several C-type lectin receptors (CLRs) including Dectin-1, Dectin-2, and Mincle. CLRs belong to the pattern-recognition receptors that play a pivotal role in antigen-presenting cells (APCs) for detecting pathogens and endogenous molecules. Loss of CARD9 has been shown to impair immune responses in different infectious diseases, especially fungal infections, and hyperinflammatory disorders. However, the role of CARD9 in viral encephalitis has not been investigated in detail yet.

The current study focuses on the effect of CARD9 deficiency on neuroinflammation and innate immune responses in C57BL/6 mice following TMEV-infection. CARD9 deficient (CARD9-/-) mice and C57BL/6 wild type control (WT) mice were sacrificed at 3, 7 and 14 days post-infection (dpi) following intracerebral viral inoculation. Histology and immunohistochemistry revealed an increased hippocampal damage in TMEV-infected CARD9-/- mice with loss of neuronal nuclear protein+ neurons in pyramidal layers and an increase of β-amyloid precursor protein+ axons, indicative of axonopathy. Moreover, the number of doublecortin+ neuronal progenitor cells in the dentate gyrus of CARD9-/- mice was significantly reduced following acute TMEV infection. The number of TMEV-infected cells and viral RNA transiently increased in the brain of CARD9-/- mice compared to WT mice during the acute infection phase. However, viral clearance at 14 dpi was not affected by CARD9 deficiency. In addition, virus spread to the brainstem and spinal cord was not increased in CARD9-/- mice. Data indicate that CARD9 deficiency does not impair viral elimination, but exacerbates neurodegeneration and impairs neurogenesis following TMEV infection.

Immunohistochemistry showed an increased sequestration of CD3+ T and CD45R+ B cells in the hippocampus of infected CARD9-/- compared to WT mice especially during the late infection phase. The finding of prolonged inflammatory responses was supported by flow cytometry showing an increased frequency of CD8+ T cells, CD4+CD62Llow T cells, and CD8+CD62Llow T cells in the spleen of CARD9-/- mice at 14 dpi. Infected CARD9-/- mice exhibited an increased infiltration of Foxp3+ regulatory T cells and elevated numbers of arginase 1+ M2-type macrophages/microglia in the hippocampus, indicating an enhancement of compensatory immune mechanism following virus-induced brain injury. Cytokine expression analyses revealed an increased transcription of interleukin (IL)-5 mRNA as well as elevated IL-1β and interferon-g mRNA levels in the brain of CARD9-/- mice compared to WT mice following TMEV infection. Expression of IL-1α, IL-4, IL-6, IL-10, transforming growth factor-β1, and tumor necrosis factor-α did not differ between groups. Oxidative stress induced lipid peroxidation and oxidative DNA damage were evaluated in mouse hippocampal tissues by immunohistochemistry. The results showed a decreased expression of the oxidative stress marker malondialdehyde in the hippocampus of CARD9-/- mice compared to WT mice, indicating that CARD9 deficiency has a limited effect on reactive oxygen species production following TMEV infection.

The present study indicates that CARD9 is dispensable for the initiation of immune responses against TMEV and viral clearance in C57BL/6 mice. However, CARD9 signaling is able to modulate inflammatory responses and thereby supporting hippocampal integrity following acute neurotropic virus infection. The underlying mechanism remains unclear and further studies are needed to get detailed insights into the regulation of CARD9 signaling and the respective CLRs involved in TMEV infection and other infectious disorders of the CNS. CARD9 represents a potential target for intervention strategies to reduce virus-induced tissue damage, which is of importance particularly in organ systems with a limited regenerative capacity like the brain.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:

Export