Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Functional and molecular properties of DYT-THAP1 dystonia and DYT-SGCE myoclonus-dystonia using patient-derived striatal medium spiny neurons

Dystonia is a rare movement disorder with sustained or intermittent muscle contractions causing abnormal, often repetitive, movements or postures. This movement disorder is clinically and genetically highly heterogeneous and comprises multiple subtypes with different manifestations. According to body distribution, dystonia can be distinguished into focal (single body region affected) or generalized dystonia. It can be further divided in isolated dystonia (dystonia is the only disease manifestation) and combined dystonia (dystonia co-occurs with other movement disorders, such as myoclonus). Current treatments are solely symptomatic and often unsatisfactory. Previous studies showed abnormalities in cerebello-thalamo-cortical and cortico-striato-pallido-thalamo-cortical pathways. Many gene mutations have recently been associated with dystonia. However, the exact pathogenic molecular pathomechanisms of its underlying neuronal dysfunction remain to be elucidated. To address these issues, the current thesis focused on disease modeling of two different genetic forms of dystonia using stem cell models to understand its functional and molecular pathomechanisms. Therefore, patient-derived induced pluripotent stem cells were differentiated into striatal medium spiny neurons (MSNs). Electrophysiological experiments including calcium imaging and whole-cell patch-clamp recordings were used to evaluate the functional phenotype of disease-specific and healthy control MSNs. Moreover, gene expression analysis as well as morphometric analysis of respective MSNs were performed.

In the first part of the thesis, the cellular phenotype from three DYT-THAP1 mutation carriers-derived MSNs compared to healthy control MSNs were investigated. DYT-THAP1 dystonia (previously referred to as DYT6 dystonia) is an adolescent-onset isolated dystonia caused by mutations in the gene THAP1 encoding for the transcription factorThanatos-associated protein (THAP) domain containing, apoptosis-associated protein 1. DYT-THAP1 dystonia is characterized by involuntary muscle contractions with site of onset in cranial or neck and usually remains as upper body involvement.

The analysis conducted within this study showed significantly elevated intracellular calcium levels and lower calcium amplitudes upon GABA and acetylcholine applications in THAP1-MSNs. In addition, a reduced expression of the gene encoding the GABAA receptor α2 subunit in THAP1 MSNs was revealed. Whole-cell patch-clamp recordings showed a significantly lowerfrequency of miniature postsynaptic currents, whereas the frequency of spontaneous APs was elevated in THAP1 MSNs. Altogether, these data suggest limited GABAergic synaptic transmission leading to decreased synaptic activity, neuronal disinhibition and potential hyperexcitability in THAP1 MSNs.

In the second part, the cellular phenotype from two DYT-SGCE myoclonus dystonia patient-derived MSNs compared to healthy control MSNs was examined. DYT-SGCE myoclonus-dystonia (previously referred to as DYT11 dystonia) is a combined dystonia characterized by a combination of rapid, brief muscle contractions (myoclonus) and repetitive movements that result in abnormal postures (dystonia). Psychiatric manifestations often accompany motor manifestations and alcohol-responsiveness to motor symptoms is known. DYT-SGCE myoclonus dystonia is caused by mutations in the gene SGCE encoding for the transmembrane protein epsilon (ε)-sarcoglycan. It is part of the dystrophin-associated glycoprotein complex linking the cytoskeleton to the extracellular matrix.

This study revealed altered calcium dynamics in SGCE MSNs including elevated basal intracellular calcium content and reduced blocking of voltage-gated calcium channels by verapamil. In addition, elevated calcium amplitudes upon glycine and acetylcholine applications were recorded in SGCE MSNs. Furthermore, increased cholinergic signaling via the muscarinic acetylcholine receptor and altered cholinergic signaling via the nicotinic acetylcholine receptor were suggested. Reduced GABAergic synaptic density was shown although the total expression of GABAA receptor subunits was not altered in SGCE MSNs. Whole-cell patch-clamp recordings revealedincreased evoked action potential amplitudes and significantly elevated amplitudes of miniature postsynaptic currents suggesting altered synaptic activity in SGCE MSNs.

In conclusion, the molecular and functional properties of DYT-THAP1 dystonia and DYT-SGCE myoclonus-dystonia patient-derived striatal medium spiny neurons were characterized.These results are valuable to gain further insight into the underlying pathological mechanisms of these diseases and contribute to the development of novel treatment strategies.

Dystonie ist eine neurologische Bewegungsstörung mit unwillkürlichen und anhaltenden Muskelanspannungen oder Verkrampfungen. Sie kann zu ungewöhnlichen Körperhaltungen und unkontrollierbaren, sich oft wiederholenden, Bewegungen führen. Diese Bewegungsstörung ist klinisch und genetisch sehr heterogen. Sie umfasst mehrere Subtypen mit unterschiedlichen Erscheinungsformen. Abhängig von den betroffenen Körperregionen werden Dystonien in fokale Dystonien (einzelne Körperregionen betroffen) oder generalisierte Dystonien unterteilt. Weiterhin werden sie in isolierte (Dystonie als einzige Krankheitsmanifestation) oder kombinierte Dystonien (Dystonie tritt mit weiteren Bewegungsstörungen wie Myoklonus auf) eingeteilt. Gegenwärtige Behandlungen sind nur symptomatisch und oft wenig zufriedenstellend. Vorherige Studien zeigten Störungen in zerebellär-thalamo-kortikalen und kortiko-striato-pallido-thalamo-kortikalen Bahnen. In den letzten Jahren wurden viele neue Mutationen in Genen identifiziert, die mit Dystonien assoziiert sind. Aber die genauen molekularen Pathomechanismen, die zu neuronalen Funktionsstörungen in Dystonien führen, müssen noch aufgeklärt werden. In diesem Kontext behandelt diese Doktorarbeit die Krankheitsmodellierung von zwei verschiedenen genetischen Formen von Dystonie mittels Stammzellmodellen, um die pathogenetischen funktionellen und molekularen Mechanismen zu verstehen. Dazu wurden induzierte pluripotente Stammzellen von Patienten zu striatalen Projektionsneuronen (PNs) differenziert. Es wurden elektrophysiologische Experimente inklusive Kalziumbildgebung und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen genutzt, um die funktionellen Phänotypen von krankheitspezifischen und gesunden striatalen PNs zu bestimmen. Zudem wurden Genexpressionsanalysen und morphometrische Analysen der jeweiligen PNs durchgeführt.

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde der zelluläre Phänotyp von PNs aus Stammzelllinien von drei DYT-THAP1-Mutationssträgern im Vergleich zu gesunden Kontrollen untersucht. DYT-THAP1 Dystonie (vorher als DYT6 bezeichnet) ist eine im Jugendalter beginnende, isolierte Dystonie. Sie wird durch Mutationen im Gen THAP1, welches das Protein Thanatos-associated protein (THAP) domain containing, apoptosis-

associated protein 1 kodiert, verursacht. DYT-THAP1 Dystonie ist durch unwillkürliche Muskelanspannungen in der Regel im Bereich des Oberkörpers charakterisiert mit häufig initialem Beginn in Nacken und Hals.

Die Experimente dieser Studie zeigten signifikant erhöhte intrazellluläre Kalziumspiegel und verminderte Kalziumamplituden nach GABA- und Acetylcholin-Applikation in THAP1 PNs. Weiterhin wurde eine reduzierte Expression des Gens, welches für die GABAA Rezeptoruntereinheit α2 kodiert, aufgedeckt. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen in THAP1 PNs zeigten signifikant niedrige Frequenzen der postsynaptischen Miniaturströme während die Amplituden evozierter Aktionspotentiale und die Frequenz spontaner Aktionspotentiale erhöht war. Insgesamt weisen diese Daten auf eine eingeschränkte GABAerge synaptische Übertragung hin, die zu reduzierter synaptischer Aktivität, neuronaler Disinhibition und möglicher Hyperexzitabilität in THAP1 PNs führt.

Im zweiten Teil wurde der zelluläre Phänotyp von PNs zweier DYT-SGCE Myoklonus-Dystonie-Stammzelllinien im Vergleich zu PNs von gesunden Kontrollen betrachtet. DYT-SGCE Myoklonus-Dystonie (vorher als DYT11 Dystonie bezeichnet) ist eine kombinierte Dystonie. Sie ist charakterisiert durch schnelle, kurze Muskelkontraktionen (Myoklonus) und wiederholende Bewegungen, die zu abnormalen Haltungen führen (Dystonie). Psychiatrische Diagnosen begleiten oft motorische Manifestationen und eine Verbesserung der Bewegungsstörungen nach Alkoholkonsum ist bekannt. DYT-SGCE Myoklonus-Dystonie wird durch Mutationen im Gen SGCE, welches das Transmembranprotein Epsilon (ε)-Sarcoglykan kodiert, verursacht. Es ist Teil des Dystrophin-Glykoprotein Komplexes, welches das Zytosklelett und die extrazelluläre Matrix verbindet.

Diese Studie hat veränderte Kalziumdynamiken inklusive erhöhtem intrazellulären Kalziumspiegel und reduzierter Blockierung von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen in SGCE PNs erkennen lassen. Zudem wurden erhöhte Kalziumamplituden nach Glycin- und Acetylcholin-Applikation in SGCE PNs aufgezeichnet. Ferner wurden gesteigerte cholinerge Signalübertragung durch muskarinerge Acetylcholinrezeptoren und gestörte cholinerge Signalübertragung durch nikotinerge Acetylcholinrezeptoren angedeutet. Eine reduzierte GABAerge synaptische Dichte wurde gezeigt, jedoch keine geänderte Expression von GABAA-Rezeptoren in SGCE PNs nachgewiesen. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ergaben erhöhte Amplituden evozierter Aktionspotentiale und signifikant erhöhte Amplituden der postsynaptischen Miniaturströme, welche auf veränderte synaptische Aktivität in SGCE PNs hinweisen.

Zusammenfassend konnten molekulare und funktionelle Eigenschaften von striatalen Projektionsneuronen charakterisiert werden, die aus induzierten pluripotenten Stammzelllinien von Patienten mit DYT-THAP1 Dystonie und DYT-SGCE Myoklonus-Dystonie differenziert wurden. Diese Ergebnisse sind wertvoll um weitere Einblicke in die ursächlichen Pathomechanismen dieser Erkrankung zu erhalten und neue Therapiestrategien entwickeln zu können.

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