Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Pharmacological preconditioning and ischaemic postconditioning in experimental jejunal ischaemia in horses

Dünndarmstrangulationen beim Pferd sind mit einer hohen Mortalitätsrate assoziiert. Obwohl viele Darmläsionen mittels einer Dünndarmresektion chirurgisch therapiert werden können, bedarf es zusätzlicher Strategien zur Reduktion von Komplikationen im Zusammenhang mit Darmsegmenten, die nicht reseziert werden können. Präkonditionierung stellt eine zunehmend populäre Maßnahme zur Behandlung von Ischämie-Reperfusionsschäden (IRS) in der Humanmedizin dar, die vor allem im Bereich der Kardiologie eingesetzt wird. Unter Präkonditionierung wird die Aktivierung protektiver, intrinsischer Zellreaktionen infolge ischämischer oder pharmakologischer Stimuli vor dem eigentlichen Vorgang der Ischämie verstanden. Manche dieser, im Rahmen der Präkonditionierung auftretenden, protektiven Mechanismen können auch nach der Ischämie, zum Zeitpunkt der Wiederherstellung der Blutversorgung, aktiviert werden. Dieses Prinzip der ischämischen Postkonditionierung (IPoC) ist eine Form der verzögerten Reperfusion, wobei die Blutversorgung direkt nach dem Beenden der initialen Ischämie erneut und wiederholt abgeklemmt wird. Die Wirksamkeit dieses Therapieansatzes wurde bereits in verschiedenen Geweben bei unterschiedlichen Tierarten nachgewiesen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der pharmakologischen Präkonditionierung (PPC) und der IPoC auf I/R im Dünndarm des Pferdes zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden zwei randomisierte, kontrollierte, experimentelle in vivo Studien durchgeführt. Für beide Studien wurde im Rahmen eines experimentellen Modells bei Pferden in Allgemeinanästhesie eine 90%ige segmentale Jejunumischämie induziert. In der ersten Studie zur Bestimmung der PPC wurden die Pferde entweder mit Xylazin (n=5) oder Lidocain (n=5) präkonditioniert. Eine historische, unbehandelte Kontrollgruppe (n=5) wurde als Vergleichsgruppe verwendet. Für die zweite Studie zur Untersuchung der IPoC, wurde bei der Testgruppe (n=7) eine verzögerte Reperfusion durch wiederholte Abklemmung der Mesenterialgefäße nach Ischämie herbeigeführt. Im Gegensatz dazu wurde bei der Kontrollgruppe die Reperfusion des Jejunums ohne weitere Maßnahmen eingeleitet. Intestinaler Blutfluss und Sauerstoffsättigung wurden in beiden Studien mittels Laser Doppler Flussmessung und Weißlicht Spektrophotometrie gemessen. Darüber hinaus wurden Dünndarmgewebeproben für histologische, immunhistochemische und biochemische Analysen entnommen. Der Vergleich zwischen den Gruppen und Zeitpunkten wurde mittels zweifacher ANOVA und entsprechender post-hoc Tests durchgeführt (p < 0.05). Für ordinale und nicht normal verteilte Daten wurden Mann-Whitney oder Kruskal-Wallis Tests für den Gruppenvergleich sowie Friedman Tests für den Vergleich der Zeitpunkte innerhalb der Gruppen verwendet.

In der ersten Studie (Manuskript 1) ergab PPC mittels Lidocain und Xylazin keine Besserung der durch I/R ausgelösten histomorphologischen Mukosaschädigung. Die Xylazin Therapie führte jedoch zu einer erniedrigten Apoptoserate und einer niedrigeren Anzahl an Entzündungszellen in der Mukosa und Serosa. Die Lidocain Therapie hatte keinen Einfluss auf diese Variablen.

In der IPoC Studie (Manuskript 2 und 3) wurde bei jedem Abklemmungszyklus die Mikroperfusion signifikant verringert. Im Gegensatz dazu wurde die Sauerstoffsättigung lediglich beim ersten Abklemmungszyklus signifikant herabgesetzt. Das Mesenterium einschließlich der dazu gehörenden Gefäße zeigte keine vermehrte Schädigung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Postkonditionierung bewirkte eine verringerte epitheliale Ablösung und Apoptoserate, sowie eine geringere parazelluläre Permeabilität der Mukosa nach Reperfusion im Vergleich zur Kontrollgruppe. Der Großteil der darüber hinaus getesteten Variablen Histomorphometrie, Zelltod, Entzündung, oxidativer Stress, und ‘heat shock response‘ waren signifikant durch das Ischämie-Modell verändert. Keiner dieser Effekte der I/R wurde allerdings durch die IPoC verringert.

In einem vierten Manuskript wurde darüber hinaus die ‘hypoxia inducible factor’ (HIF) Antwort im Ischämiemodell sowie der Einfluss von IPoC beschrieben. Nach Reperfusion war die mukosale HIF-1α Immunreaktivität signifikant höher im Vergleich zur Prä-Ischämie. Die HIF-2α Immunreaktivität veränderte sich nicht während Reperfusion und Ischämie. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass vorrangig der Transkriptionsfaktor HIF-1α und nicht HIF-2α eine Rolle bei der intestinalen Antwort auf Ischämie spielt. IPoC hatte keinen Einfluss auf das Immunreaktivitätsmuster der beiden Faktoren.

Aufgrund der mit Xylazin PPC einhergehenden Reduktion der apoptotischen und entzündlichen Zellen, kann davon ausgegangen werden, dass Xylazin einen positiven Effekt auf intestinale I/R hat. Dieses Ergebnis unterstützt die Anwendung von Xylazin bei sedativer Analgesie und bei Anästhesieprotokollen bei Pferden mit strangulierenden Dünndarmläsionen. IPoC war zuverlässig und sicher durchzuführen und die Ergebnisse suggerieren einen protektiven Effekt auf I/R assoziierte Beeinträchtigungen der Dünndarmmukosa. Mögliche Wirkungsmechanismen wie das oxidative Stress-Niveau, HIF und ‘heat shock response’ wurden untersucht, jedoch nicht von IPoC beeinflusst. Das Konzept der IPoC stellt eine Therapieoption mit Potenzial für den Kolikpatienten dar. Nichtsdestotrotz bedürfen der Wirkungsmechanismus und die langfristigen Auswirkungen weiterer Untersuchungen bevor IPoC bei klinischen Fällen zum Einsatz kommen kann.

Strangulating obstruction of the small intestine in the horse is associated with a high mortality rate. Although many intestinal lesions can be treated surgically by intestinal resection, more effective strategies are needed to decrease the occurrence of complications related to the intestinal segments that are not amenable to resection. Preconditioning represents an increasingly popular treatment modality for ischaemia-reperfusion (I/R) injury in human medicine, and is predominantly applied in cardiology. It refers to the activation of intrinsic cell survival programmes after exposure to mild ischaemic stimuli or pharmacologic agents prior to an ischaemic event. Some of the protective mechanisms exerted by preconditioning may also be activated after ischaemia, as the blood supply is being reinstated. This principle of ischaemic postconditioning (IPoC) is defined as delayed reperfusion, and is performed by the repeated re-occlusion of the blood supply immediately after an ischaemic event. These treatment strategies have been shown to significantly ameliorate ischaemia reperfusion injury in different tissues and species.

The aim of this study was to determine the effect of pharmacological preconditioning (PPC) and IPoC on small intestinal I/R injury in horses. To achieve this, we performed two randomized controlled experimental in vivo studies. In both experiments, segmental jejunal ischaemia with 90% flow reduction was implemented in horses under general anaesthesia. In the first study, the horses were pharmacologically preconditioned with either xylazine (n=5) or lidocaine (n=5). A historical, untreated control group (n=5) was used for group comparison. In the second study, investigating IPoC, the test group (n=7) was subjected to delayed reperfusion by repeated clamping of the mesenteric vessels after ischaemia. In the control group (n=7), the jejunum was reperfused without further intervention. In both studies, the intestinal microperfusion and tissue oxygen saturation were measured using laser Doppler flowmetry and white light spectrophotometry. Furthermore, intestinal tissue samples were collected for histology, immunohistochemical staining, and biochemical analysis. Comparison of these variables between the groups and time points were performed using a 2-way repeated measures ANOVA with appropriate post-hoc tests (p < 0.05.). For ordinal and not normally distributed data, Mann-Whitney or Kruskal-Wallis tests were used for group comparison, and a Friedman test for comparisons of the time points within the groups.

As described in the first manuscript, PPC with lidocaine and xylazine did not ameliorate the I/R induced histomorphological changes. Xylazine treatment did result in a lower apoptotic cell count after ischaemia, and fewer inflammatory cells in the mucosa and serosa after reperfusion compared to the control group. Lidocaine treatment had no effect on I/R induced apoptosis and inflammation compared to the other groups.

In the IPoC study, as reported in the second and third manuscript, postconditioning clamping of the mesenteric vessels effectively reduced the intestinal microperfusion during all clamping cycles, yet affected tissue oxygenation only during the first cycle. The mesentery and its vessels did not show any signs of increased tissue damage after IPoC compared to the mesentery of the control group. Postconditioning resulted in reduced epithelial denudation, a lower apoptotic cell count and decreased paracellular permeability after reperfusion compared to the control group. The majority of the other tested variables for histomorphometry, cell death, inflammation, oxidative stress, and heat shock response were significantly affected by the ischaemia model as indicated by differences between the time points. However, none of these I/R responses were modified by IPoC.

The fourth manuscript describes the hypoxia inducible factor (HIF) response in this experimental model including the effect of IPoC. Significant changes were seen in mucosal HIF-1α immunoreactivity after reperfusion compared to pre-ischaemia, yet HIF-2α did not show any progression during ischaemia or reperfusion. These results suggest that transcription factor HIF-1α and not factor HIF-2α plays a role in the intestinal response to ischaemia. No effect of IPoC could be found on the immunoreactivity patterns of these hypoxia inducible factors.

In conclusion, xylazine PPC was associated with a reduction in apoptotic and inflammatory cells, indicating a beneficial effect of xylazine on intestinal I/R injury. These results would support the use of xylazine in sedative analgesia and anaesthetic protocols for horses with strangulating small intestinal lesions. IPoC was feasible and safe to perform, and the results suggest a possible protective effect of IPoC on I/R induced mucosal injury. Several potential mechanisms such as oxidative stress levels, HIF and heat shock response were investigated, yet were not affected by IPoC. The concept of IPoC may be a feasible therapeutic strategy with potential benefits for the colic patient; however, the exact mechanism and its long-term effects need to be elucidated before this can be implemented in clinical cases.

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