Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characteristics of live virus-induced immunity against tick-borne encephalitis

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a zoonotic virus, that belongs to the family Flaviviridae. It is primarily transmitted by ticks, in rapidly increasing risk areas in Europe and Asia. In a minority of infected individuals, the virus can induce severe diseases such as encephalitis, meningitis or meningoencephalitis even leading to death. Those patients, who survive severe neurological illness, may display temporary or life-long sequalae such as paresis of extremities, Kozhevnikov epilepsy or memory and concentration impairment. Currently, the options for pharmaceutical intervention strategies are limited with no specific antiviral treatment available. Formalin-inactivated whole-virus vaccines have been developed but time-consuming vaccination schedules and periodic boosters are necessary to maintain adequate immunity, which however does not fully prevent occasional breakthroughs. In an attempt to establish a different vaccination strategy, the use of the low-virulent closely related flavivirus Langat virus (LGTV) was explored as a live-attenuated vaccine in the Soviet Union in the 1970s. After cases of encephalitis were reported among 1 in 20,000 vaccinated participants, the clinical use of LGTV as a potential live vaccine was stopped. LGTV-driven correlates of protection against TBEV were never thoroughly investigated.       

The first part of this thesis focuses on LGTV-driven protection from subsequent TBEV challenge in mice. We showed total protection from lethal TBEV (Hypr strain) challenge upon immunization with LGTV or a naturally avirulent TBEV strain (TBEV-280) in mice. Although immunized mice were protected from a lethal infection, development of clinical symptoms and infection of peripheral organs, TBEV RNA was still detected by quantitative real-time PCR in the central nervous system (CNS). However, no TBEV antigen could be detected in these protected mice by immunofluorescence, using a TBEV E-protein specific antibody. Nevertheless, indications of a past virus infection such as gliosis, neuronal necrosis or inflammation were detected. This led to the conclusion that LGTV and TBEV-280 immunization induced protection from lethal TBEV infection but did not fully induce protection from virus entry into the brain. These findings are of particular interest in the light of vaccination breakthroughs of TBEV infection that have been reported in vaccinated individuals.

In the second part of this thesis, we investigated correlates of protection against TBEV infection, induced by low-virulent LGTV infection. To this end, an adoptive transfer was carried out with sera and individually collected CD3+, CD4+ and CD8+ T cell populations from LGTV-immunized mice prior to fatal TBEV Hypr challenge. This allowed us to identify serum containing virus-neutralizing antibodies as a major correlate of protection from fatal and clinical disease. However, transfer of the respective T cell populations from the immunized mice failed to provide such protection. The reason for this is not completely clear and could be attributed to several factors such as too high a dose of virus or limited frequency of virus-specific T cells that were transferred. Both options are currently being investigated.    

The third part of this thesis, focuses on the establishment of a reverse genetics system of LGTV TP21. We successfully cloned and rescued infectious particles from an RNA template. This provides a valuable tool for further studies into the potential of live-attenuated vaccine candidates for TBEV infection. With the advent of this reverse genetics system several additional opportunities such as genome modifications and insertion of reporter proteins will pave the way for investigating dynamics and localization of flavivirus infections.

In sum, these studies provide leads for our understanding of limitations associated with the use of LGTV as a live-attenuated vaccine against TBEV infection, by demonstrating pathological consequences of apparently asymptomatic TBEV infection of the murine CNS. An adoptive transfer study identified serum containing LGTV-neutralizing antibodies as a correlate of protection from TBEV infection. Finally, the LGTV reverse genetics system developed in this study will not only allow us to contribute to the development of a live-attenuated vaccine candidate for tick-borne encephalitis but will also create novel opportunities for investigating flavivirus infections.

Das Frühsommer-Meningoencephalitis Virus (FSME) ist ein zoonotisches Virus, das sich in die Familie der Flaviviridae eingliedert. Das Virus wird hauptsächlich über Zecken, in schnell wachsenden Risikogebieten in Europa und Asien übertragen. Bei einem geringen Teil der infizierten Patienten kann die Infektion zu Enzephalitis, Meningitis, Meningoenzephalitis oder sogar zum Tod führen. Patienten, die einen schweren neurologischen Verlauf überlebt haben, können temporäre oder lebenslange Folgeerkrankungen wie z.B. Parese von Extremitäten, Kozshevnikov’s Epilepsie oder auch Gedächtnis- und Konzentrationsschwächen entwickeln. Gegenwärtig sind die möglichen pharmazeutischen Behandlungsstrategien limitiert und keine spezifische, antivirale Therapie vorhanden. Auf dem Markt sind aktuell lediglich Formalin-inaktivierte Ganzvirus-Impfstoffe erhältlich, die einen aufwändigen Impfplan und regelmäßige Auffrischimpfungen erfordern, um eine dauerhafte Immunität sicherzustellen. Zudem wurde von gelegentlich auftretenden Krankheits-Durchbrüchen trotz Impfung berichtet. In den 1970er Jahren wurde in der Sowjetunion eine klinische Studie durchgeführt, in der Langat Virus (LGTV), ein niedrig pathogenes, nahverwandtes Flavivirus, als lebend-attenuierter Impfstoff getestet wurde. Die klinische Stude wurde gestoppt, nachdem bei 1 von 20.000 geimpften Freiwilligen eine Enzephalitis diagnostiziert wurde. Die LGTV-induzierte protektive Immunantwort gegen FSME wurde nie tiefergehend untersucht.       

Der erste Teil dieser Doktorarbeit fokussiert sich auf den LGTV-induzierten Schutz vor einer FSME-Infektion in der Maus. Wir konnten nach einer Immunisierung mit LGTV bzw. einem avirulentem FSME Stamm (FSME 280) einen vollständigen Schutz vor einer letalen FSME-Infektion (Stamm Hypr) in Mäusen nachweisen. Obwohl die immunisierten Mäuse vor einem tödlichen Krankheitsverlauf, dem Auftreten klinischer Symptome und vor Infektionen der peripheren Organe geschützt waren, konnte mittels quantitativer real-time PCR dennoch FSME RNA im zentralen Nervensystem (ZNS) nachgewiesen werden. Trotz der detektierten FSME RNA konnte mit einem FSME E Protein-spezifischen Antikörper per Immunfluoreszenz-Färbung kein FSME-Protein in den immunisierten Mäusegehirnen nachgewiesen werden. Dennoch wurden Indikatoren für eine zurückliegende Virusinfektion wie Gliose, neuronale Nekrosen und Entzündungen mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung detektiert. Daraus schlussfolgerten wir, dass die Immunisierung mit LGTV oder FSME 280 vor einer tödlichen FSME Hypr Infektion schützen kann, jedoch keinen vollständigen Schutz vor einer Infektion des Gehirns bietet. Diese Erkenntnisse sind angesichts der Krankheits-Durchbrüche von FSME-geimpften Personen von besonderem Interesse.

Im zweiten Teil der Arbeit haben wir die LGTV-induzierte protektive Immunantwort gegen FSME genauer untersucht. Aus diesem Grund wurden Serum sowie CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zell Populationen von LGTV-immunisierten Mäusen in naive Mäuse transferiert und diese anschließend mit einer tödlichen FSME Hypr Dosis injiziert. Dieser Versuchsaufbau verdeutlichte, dass Serum und die darin enthaltenen neutralisierenden Antikörper vor einem klinischen Krankheitsverlauf und einem tödlichen Ausgang schützen können. Der Transfer der T-Zell Populationen von LGTV-immunisierten Mäusen lieferte jedoch keinen solchen Schutz. Die Gründe hierfür sind nicht abschließend bekannt und können vielfältig sein. Die mögliche Ursache einer zu hohen Virus-Dosis in Kombination mit einer zu niedrigen Anzahl an transferierten virus-spezifischen T-Zellen wird aktuell untersucht. 

Der dritte Teil der Arbeit widmet sich eines Reversen Genetik Systems für LGTV TP21. Infektiöse Viruspartikel konnten bereits erfolgreich aus dem RNA-Template generiert werden. Das Reverse Genetik System stellt ein nützliches Hilfsmittel für weitere Studien zu einem möglichen lebend-attenuierten Impfstoff gegen eine FSME-Infektion dar. Darüber hinaus ermöglicht dieses Reverse Genetik System beispielsweise über Genom-Modifikationen und das Einfügen von Reporter-Proteinen die Untersuchung der Dynamik und Lokalisation von Flavivirus-Infektionen.

Zusammenfassend liefern diese Studien Hinweise darauf, dass es nach einer vermeintlich asymptomatischen FSME-Infektion in der Maus, zu pathologischen Konsequenzen im ZNS kommen kann. Dieses Wissen führt zu einem besseren Verständnis der Limitierungen für den Einsatz von lebend-attenuierten Impfstoffen wie LGTV. Die adoptive Transfer Studie identifizierte LGTV-induzierte kreuzprotektive Antikörper bereits als einen wirksamen Schutz vor einer klinischen FSME-Manifestation. Das etablierte Reverse Genetik System wird nicht nur dazu beitragen, Informationen für einen möglichen lebend-attenuierten Impfkandidaten für FSME zu generieren, sondern ermöglicht ebenfalls neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Flavivirus-Infektionen

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